粘质沙雷氏菌在太空飞行后变化的初步研究

摘要

目的:细菌会随着人类或航天器部件进入太空,有研究表明细菌在空间环境作用下毒力增强,然而,关于这一效应的普遍性及机制尚未完全阐明。粘质沙雷氏菌是一种常见的临床条件致病菌,曾在空间站多次检出。本研究利用神舟八号飞船搭载的机会,采用表型研究相关实验,并利用比较基因组学、转录组学以及蛋白质组学的生物信息学方法探索粘质沙雷氏菌经历了空间飞行环境作用后的变化,并初步探讨其机制。
　　方法:(1)粘质沙雷氏菌通过神舟八号飞船搭载获得空间飞行实验组,地面设同步温度对照组,实验组及对照组均经过16SrDNA进一步验证。(2)通过革兰氏染色、纸片法耐药实验、溶血实验、生长曲线测定,Biolog法对空间飞行粘质沙雷氏菌株和地面对照菌株进行形态、耐药性、溶血性、生长速率、生化代谢谱的观察比较,明确空间飞行株的生物学特性,并获得粘质沙雷氏菌变异株LCT-SM166、LCT-SM262、地面对照株为LCT-SM213。(3)采用高通量Illumina测序技术对样品LCT-SM166、LCT-SM262、LCT-SM213进行Paired-End测序。对产出的数据进行Denovo组装,并进行基因预测及注释分析。对空间变异菌株和地面对照菌株进行比较基因组学分析,包括进化分析、共线性及重排分析、质粒鉴定及差异分析、SNP分析及注释、InDel差异分析及注释、CorePan分析等。(4)采用Illumina HiSeq2000进行转录组测序。对下机的数据进行测序评估、基因表达注释、预测新转录本等分析,基因表达量的计算使用RPKM法,差异表达分析找出表达量在不同样本间存在差异的基因,差异表达基因定义为FDR≤0.001且倍数差异在2倍以上的基因。对差异表达基因进行模式聚类、GO和KEGG pathway功能富集分析。(5)使用iTRAQ蛋白组学技术对LCT-SM166、LCT-SM262、LCT-SM213进行蛋白质的鉴定,定量。根据差异倍数1.2倍和P<0.05的标准,筛选经过空间飞行的粘质沙雷氏菌LCT-SM166、LCT-SM262相对于地面对照株LCT-SM213具有显著差异表达的蛋白。并对这些蛋白进行CO、COG和KEGG功能分析、聚类分析和富集分析。
　　结果:(1)利用16SrDNA鉴定到36株粘质沙雷氏菌,空间飞行株为32株,地面对照株为4株。(2)32株空间飞行株和4株地面对照株比较,对所选抗生素(包括青霉素G、氨苄青霉素、头孢唑林、头孢他啶、头孢三嗪、阿奇霉素、环丙沙星、洁霉素、万古霉素、复方新诺明、氯霉素、舒普深、丁胺卡那、链霉素、美满霉素、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦)均敏感,均未见溶血反应,Biolog实验显示生化代谢谱有差异,筛选出差异较大的两株变异株LCT-SM166和LCT-SM262,地面对照株为LCT-SM213。主要表现为:地面对照株D-棉子糖(D-Raffinose)阴性,而空间搭载株出现显著阳性反应;地面对照株N-乙酰神经氨酸(N-Acetyl neuraminic acid)和D-甘露醇(D-Mannitol)呈弱阳性反应,而两株空间搭载菌均为阳性反应。变异株的形态、生长曲线较地面对照株无变化。(3)基于全基因组测序的结果,以地面对照株LCT-SM213为参考序列,粘质沙雷氏菌变异株LCT-SM262、LCT-SM166没有发现基因的缺失、重排;SNP差异分析发现有12个杂合SNP,InDel差异分析、Core Pan分析以及质粒差异分析结果均为阴性。(4)转录组差异基因表达分析示,同地面对照株LCT-SM213比较,变异株LCT-SM166有6个基因发生上调,67个基因发生下调。变异株LCT-SM262有20个基因发生上调,5个基因发生下调。COG功能注释显示这些差异基因大部分都和细菌的代谢相关。(5)差异蛋白组学分析结果示,同地面对照株LCT-SM213比较,变异株LCT-SM166发生上调的蛋白为21个,下调的蛋白为90个,LCT-SM262发生上调的有65个,下调的有11个,差异蛋白的富集分析显示两株诱变株共同的KEGG富集通路有糖酵解/糖异生、丙酮酸盐代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解。经过聚类分析发现9个蛋白在两株细菌中均出现下调表达,其功能多与细菌的代谢有关系。
　　结论:(1)神舟八号飞船搭载后返回地面的粘质沙雷氏菌,发生变化的主要表现为对碳源的利用改变,这些变化可能与其空间环境的适应性生存有关。
　　(2)空间飞行后的粘质沙雷氏菌分离出的变异株中检测到12个经过验证的杂合SNP。
　　(3)转录组学和蛋白质组学分析获得了差异表达基因(DEG)和差异表达蛋白(DEP),DEG和DEP的富集分析提示这些差异表达的基因和蛋白多是和细菌的能量代谢有关。

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前 言

第一部分 粘质沙雷氏菌空间变异株的筛选和表型研究

第一节 实验材料和方法

1.实验菌株

3.菌株的培养和保存

4.菌株的16s rDNA鉴定实验流程

5.菌株的耐药性试验

6.菌株的溶血试验

7.菌株的Biolog试验

8.粘质沙雷氏菌变异株的形态检测

9.粘质沙雷氏菌变异株的生长曲线

第二节 实验结果

1. 菌株的16s rDNA鉴定结果

2.菌株耐药实验结果

3.菌株溶血实验结果

4.菌株的Biolog实验结果

5.变异株形态观察结果

6.粘质沙雷氏菌变异株的生长曲线

第三节 讨 论

第二部分 粘质沙雷氏菌空间变异株的基因组转录组及蛋白质组学研究

第一节 实验材料和方法

1.实验菌株

2.粘质沙雷氏菌变异株基因组研究方法

3.比较基因组学分析方法

4.粘质沙雷氏菌变异株的转录组学研究方法

5.粘质沙雷氏菌变异株差异蛋白组学分析方法

第二节 实验结果

1.粘质沙雷氏菌变异株基因组研究结果

2.比较基因组学分析结果

3.转录组学测序分析结果

4.粘质沙雷氏菌变异株的差异蛋白组学分析结果

第三节 讨 论

实验结论

参考文献

综述

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