N-糖酰胺酶F的表达纯化鉴定及Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白SNAT1的多克隆抗体制备

摘要

N-糖酰胺酶F(PNGase F)主要是由革兰氏阴性菌-脑膜炎脓杆菌分泌的一种分子量为34.8kDa的去糖基化酶。具有广泛的底物专一性，对所有类型的N-连接的糖蛋白都有作用，能从糖蛋白完整切下N-寡糖链，其作用位点是N-乙酰葡萄糖胺残基和天冬酰胺之间的价键结构，同时将蛋白质的天冬酰胺残基转化为天冬氨酸，生成的氨基寡糖链随后水解成氨气和寡糖。本研究首先通过PCR技术扩增出945bp的N-糖酰胺酶F基因，经酶切、连接，构建了大肠杆菌表达载体pET28a-PNGase F。将pET28a-PNGase F转入大肠杆菌BL21中，16℃诱导表达及Ni柱纯化后，SDS-PAGE鉴定，获得超过95％纯度的可溶性表达的N-糖酰胺酶F。对以后N-糖酰胺酶F的相关研究起到了重要的推动作用。
　　钠离子偶联的中性氨基酸转运蛋白(Sodium-coupled Neutral Amino Acid Transporter，SNAT)属于SLC38基因家族。SLC38家族又分为System A和System N两个亚族，其中SNAT1和SNAT2属于System A，SNAT3属于System N，具有重要的生理功能，其功能紊乱可引起神经退行性疾病。我们通过分子克隆技术构建了pBK-CMV△-SNAT3-HA重组质粒，并通过Western blot技术证明SNAT3-HA融合蛋白正常表达，且能正常定位于细胞膜上。为了检测纯化的N-糖酰胺酶F脱糖基化功能，本文以SNAT1、SNAT2和SNAT3为底物，通过检测它们经N-糖酰胺酶F消化后在SDS-PAGE中迁移率的变化来研究N-糖酰胺酶F的脱糖基化作用。证明我们纯化的PNGase F具有高效的脱糖基化功能，同时证实了SNAT1、SNAT2和SNAT3分子中含有糖基化位点的假设。这对研究SNAT1、SNAT2和SNAT3的结构与功能提供了有效的工具。
　　Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白SNAT1被预测具有11个跨膜区域，其N端在细胞内，C端在细胞外。本研究通过将潜在糖基化位点中的Asn突变成Gln，利用Western-blot技术通过蛋白质电泳迁移率的变化研究SNAT1中糖基化位点的数量及位置，证明了SNAT1中存在两个糖基化位点，分别为N251和N257位。为SNAT1膜拓扑结构的进一步研究起到了重要的辅助作用。
　　目前，还没有特别适用的有效SNAT1特异性抗体，极大地阻碍了SNAT1结构与功能的深入研究。本研究通过分子克隆的方法构建了一个蛋白表达载体pET28a-SNAT1-75aa，通过诱导表达纯化后，将SNAT1 N端75个氨基酸作为免疫原，经过3次免疫注射新西兰大白兔获得血清，利用巯丙基琼脂糖凝胶6B亲和纯化后，获得了SNAT1特异性的抗体。为以后SNAT1结构与功能的深入研究提供了有效的工具。

目录

摘要

中英文缩略词对照表

第一章 综述

1 N-糖酰胺酶F

1．1 N-糖酰胺酶F研究现状

1．2 N-糖酰胺酶F结构与功能的研究

1．3 N-糖酰胺酶F的催化机制

2 糖生物学研究

2．1 糖蛋白与糖基化

2．2 寡糖链对糖蛋白的影响

3 Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白

3．1 SLC38家族简介

3．2 Na+偶联的中性氨基酸转运蛋白研究进展

4 抗体的研究进展

4．1 多克隆抗体制备方法的研究进展

4．2 抗体的分离纯化技术研究进展

第二章 N-糖酰胺酶F(PNGase F)在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

0 前言

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 pET28a-PNGase F重组质粒的构建

2．2 pET28a-PNGase F重组质粒的鉴定

2．3 N-糖酰胺酶F诱导表达条件的探索

2．4 N-糖酰胺酶F的大量表达与纯化

3 讨论

第三章 N-糖酰胺酶F的脱糖基化作用鉴定

0 前言

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 pBK-CMV △-SNAT3-HA重组质粒的构建

2．2 pBK-CMV △-SNAT3-HA重组质粒的鉴定

2．3 Western blot检测SNAT3-HA融合蛋白的表达结果

2．4 N-糖酰胺酶F的脱糖基化作用

3 讨论

第四章 SNATl糖基化位点研究

0 前言

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 研究方法

2 结果

2．1 定点突变结果

2．2 Western-blot验证糖基化位点结果

3 讨论

第五章 钠离子偶联的中性氨基酸转运蛋白1(SNAT1)多克隆抗体的制备

0 前言

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 pET28a-SNAT1-75aa重组质粒的构建

2．2 pET28a-SNAT1-75aa重组质粒的鉴定

2．3 SNAT 1-75aa蛋白的预表达测试

2．4 SNAT 1-75aa蛋白的大量表达与纯化

2．5 Wstern blot检测SNAT1抗体的效果

3 讨论

致谢

参考文献

附录 攻读硕士学位期间发表的学术论文

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