含腈水解酶重组大肠杆菌生物催化1-氰基环己基乙腈的研究

摘要

本文主要研究了含腈水解酶重组大肠杆菌的培养条件优化、催化反应条件优化以及用海藻酸钙-戊二醛-聚乙烯亚胺对含腈水解酶重组大肠杆菌的固定化，并生物催化水解1-氰基环己基乙腈，高产率的生产有机合成和医药中间体1-氰基环己基乙酸。
　　论文的第二章主要采用摇瓶发酵优化的方式，对含腈水解酶重组大肠杆菌的培养条件进行了单因素优化，研究了培养基组分（碳源、氮源）和发酵条件（培养温度、起始 pH值、接种体积分数、摇瓶装液量、诱导剂IPTG的加入时间、诱导剂的终浓度、产酶周期)对产酶的影响。结果表明：该菌产酶最佳培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，NaCl5g/L；最适发酵条件为：培养温度为30℃，起始 pH值为7.0，接种体积分数为4％，摇瓶装液量为20%，诱导剂IPTG的加入时间为4h，诱导剂IPTG的终浓度为0.2mM，发酵周期为10h，该菌种的腈水解酶活性达到50.60U/g，较优化前提高了很多。
　　论文的第三章，主要是研究了各种条件对于腈水解酶的催化活性的影响，其中包括有机溶剂、催化剂细胞量、反应时间、反应温度及稳定性、反应pH值及温度稳定性、反应体积、底物粒径、底物抑制试验、产物抑制试验、放置天数对酶活影响。实验结果显示酶的催化活性在底物浓度为1mol/L，细胞量15g/L，在不添加任何助溶剂的pH为7.3的5ml的磷酸盐缓冲液、30℃反应时转化率较高。且底物粒径对反应没有影响，也没有底物抑制现象，但是通过产物抑制实验证明该反应存在产物抑制。
　　论文的第四章，主要是研究了一种固定化细胞的方法，即海藻酸钙-戊二醛-聚乙烯亚胺细胞固定化法。对固定化的工艺条件进行了优化，确定了最适的工艺条件：包埋细胞量30g/L，海藻酸钠浓度是2g/100mL，硬化时间为12h，戊二醛的浓度为0.1M，聚乙烯亚胺的浓度为0.143mM，分别在这两种溶液中搅拌20min。之后又考查了固定化细胞的性质并与游离细胞进行对比，固定化细胞和游离细胞的最适温度分别是70℃和60℃，最适pH分别是8.0和7.3，且固定化细胞在偏碱性和高温下的稳定性都有所提高。将固定化细胞储存在30mM氯化钙的Tris-HCL缓冲液中4℃保存55天仍有59.7%的酶活，而游离细胞只有26.67%的酶活。在最终的循环利用中，当二腈底物浓度是0.5M，细胞量为35g/L时，可以循环利用20次转化率仍没降低，经折算产率为每天每升转化生产166.19g1-氰基环己基乙酸，而游离细胞循环5次后转化率开始降低，到第20次后转换率只有6%。并且在循环反应液中添加钙离子的实验证实，加入钙离子的循环反应，反应了20次仍没有固定化细胞的破碎情况且没有酶活损失，而没有加入钙离子的循环反应，7次后固定化细胞就全部破碎，不能继续反应。可见在固定化细胞的循环反应液中加入一定量的钙离子可以维持固定化细胞的结构，增加固定化细胞的反应批次，提高产率。

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第一章 绪论

1.1 腈化合物的简介及研究意义

1.2 羧酸化合物简介及研究意义

1.3 制备羧酸化合物的方法

1.4 生物催化简介

1.5 用腈水解酶生物催化制备羧酸化合物及其在工业中的应用

1.6 固定化细胞技术概况

1.7 本论文的研究意义及思路

第二章 含腈水解酶重组大肠杆菌的发酵优化

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 含腈水解酶重组大肠杆菌的反应优化

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 含腈水解酶重组大肠杆菌的固定化及性能研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3结果与讨论

4.4 本章小结

总结与展望

参考文献

致谢

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