基因分型技术对益生菌婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌鉴定的研究

摘要

双歧杆菌是人体或动物消化道中最重要的一种生理性益生菌，于1899年由法国巴斯德研究所学者Tissier从母乳喂养儿的粪便中分离发现，随着对双歧杆菌的深入研究发现，双歧杆菌能产生特殊物质，抑制致病细菌的入侵，进而起到调节身体免疫能力的作用，此外双歧杆菌还在维持体内微生态平衡、营养、协同降解多糖等多方面具有重要的生理功能，因此该菌种逐渐被应用于各种婴幼儿食品、药品、保健品中。
　　国家为了益生菌乳制品的安全监管，严格规范乳制品中菌株的使用，颁布了《关于公布可用于婴幼儿食品的菌种名单的公告》（卫生部公告2011年第25号），与《GB10765-2010食品安全国家标准婴儿配方食品》等制度，规定了可用于婴幼儿乳制品等产品中的菌种类型和数量，此外国家标准《GB4789.34-2012食品安全国家标准食品微生物学检测双歧杆菌的鉴定》中明确规定了食品中双歧杆菌的常规检测方法，该常规检测方法主要针对菌种的数量或常见菌种的生理生化进行实验，部分方法种属特异性不高、重复性较差，并且仅通过生理生化检测，不能将菌种鉴定到菌株水平，不能达到卫生部公布中规定的特定菌株的监管要求。
　　分子分型技术是近几年发展起来的一种新型生物学技术，主要依据菌种的基因序列进行菌种之间的鉴定分型，包含脉冲场凝胶电泳方法(PFGE)、限制性片段长度多态性分析法（RFLP）以及以PCR为基础的多重PCR法、随机扩增多态性DNA技术法(PCR-RFLP)、16S rRNA测序技术、多位点基因分型技术(MLST)等，其中16S rRNA基因序列是菌种进化的“活化石”，基于16S rRNA基因序列的分型技术是国际上公认的较为广泛的菌种鉴定方法;16S-23S rRNA基因区间是位于16S rRNA基因与23S rRNA基因之间的区间序列，相对于16S rRNA基因的高保守性，该基因区间具有更多的可变区，可用来分辨序列非常接近的菌种和种内菌株;多位点序列分型技术(MLST)是Maiden等学者通过改良多位点酶电泳所形成的一种新型分子分型方法，该技术以菌种的7个管家基因为依据进行分型，既具有一定的保守性，又具有一定的可变性，能够更准确的表现菌种之间的亲缘关系。
　　本文主要利用基于16S rRNA基因序列、基于16S-23S rRNA基因序列和基于MLST的基因分型技术，结合系统进化分析，对12株双歧杆菌标准菌株和从20个益生菌乳粉样品中分离得到的30个样品菌株进行研究，建立基因分型技术对益生菌婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌鉴定的三种分析分型方法，主要的研究结果如下:
　　(1)通过调研和品牌官方网站访问等方式发现国内生产益生菌婴幼儿乳粉的品牌占国内乳粉品牌的36.4％，而在益生菌婴幼儿乳粉中，75％为添加益生菌的婴幼儿牛乳粉，25％为益生菌婴幼儿羊乳粉;在对购买的乳粉样品标签整理中发现，部分乳粉标签对菌株的相关信息或菌种含量的标注较为规范，国内品牌的标签合格率在83％以上，进口品牌的标签合格率不足50％。
　　(2)通过对购买样品的活菌数量检测，得知20个样品中16个样品中活性益生菌的数量达到国家标准，合格率为90％。标签标示中菌株信息和活菌数量均符合国家标准的样品数量为13，占所有样品的65％。
　　(3)通过对12株标准双歧杆菌和30株样品菌株16S rRNA引物进行扩增测序，利用系统进化树分析，该技术能将双歧杆菌的不同菌种进行区分，16S rRNA发育树中大多数分支的bootstrap值大于80，具有较好的分辨性;在对标准菌株中动物双歧杆菌的亚种进行分型鉴定中，只能区分动物双歧杆菌动物亚种与其他动物双歧杆菌乳亚种，而乳亚种之间不能够区分，原因主要与菌种16S rRNA基因的高度保守性有关联;在对样品进行分析时，能够较为准确的对样品菌株进行区分。
　　(4)利用16S-23S rRNA分型技术结合系统进化树分析对12株标准双歧杆菌和30株样品菌株进行鉴定分型，其分型鉴定结果与16S rRNA分型技术相似，能够准确的将双歧杆菌区分到亚种水平，且区分度达到90以上;在对样品分离菌株进行鉴定中，该技术的分辨率达到85以上，相对于基于16S rRNA的分型技术具有较高的分辨性。
　　(5)基于多位点测序的分型技术，能够准确区分双歧杆菌的五个双歧杆菌菌种，且区分度达到100，此外，该技术能够将动物双歧杆菌乳双歧杆菌亚种菌株(B.animalis.ssp.lactis ATC C27673）与其他乳双歧杆菌亚种区分开，鉴定到亚种内水平，比基于单基因位点的分型技术具有更高的分辨能力;利用该分型技术对样品菌株鉴定的结果与样品标识信息基本相符。

目录

摘要

第1章 绪论

1．1 双歧杆菌的理化特征、分类及生理功能

1．2 双歧杆菌的鉴定检测方法

1．2．1 双歧杆菌的生理生化鉴定

1．2．2 双歧杆菌的分子学检测技术

1．2．3 16SrRNA基因分型技术在双歧杆菌中的应用研究

1．2．4 16S-23S rRNA基因分型技术在双歧杆菌中的应用研究

1．2．5 MLST技术概论以及在双歧杆菌中的应用研究

1．3 课题研究目的和意义

1．3．1 研究背景

1．3．2 主要的研究内容

第2章 益生菌婴幼儿配方乳粉的市场调研分析

2．1 材料

2．1．1 仪器与设备

2．1．2 培养基的制备

2．2 样品乳粉的菌数统计

2．3 结果分析

2．3．1 国内益生菌婴幼儿配方乳粉的市场调研分析

2．3．2 益生菌婴幼儿配方乳粉标签标示问题分析

2．3．3 样品中益生菌含量的测定结果

2．4 本章小结

第3章 乳粉菌种16S rRNA基因分型技术的建立

3．1 材料

3．1．1 标准菌株及样品菌株

3．1．2 仪器与设备

3．1．3 试剂与培养基

3．2 标准菌株与样品菌株核酸提取

3．2．1 菌株分离和培养

3．2．2 核酸提取步骤

3．3 16SrPCR扩增和产物分析

3．4 结果与分析

3．5 标准菌株与样品分离菌株16S rRNA基因分型技术的研究

3．5．1 标准菌株与样品分离菌株电泳结果与测序序列比对

3．5．2 基于16S rRNA基因分型技术的建立

3．5．3 基于16S rRNA基因分型技术对样品分离菌株的鉴定

3．6 本章小结

第4章 乳粉菌种16S-23S rRNA基因分型技术的建立

4．1 材料

4．1．1 标准菌株及样品菌株

4．1．2 仪器与设备

4．1．3 PCR扩增试剂

4．2 16S-23S rPCR扩增和产物分析

4．3 16-23S rRNA基因分型技术的建立

4．3．1 菌株电泳结果分析与测序序列比对

4．3．2 基于16-23S rRNA基因分型技术的建立

4．3．3 基于16-23S rRNA基因分型技术对样品分离菌株的鉴定

4．4 本章小结

第5章 乳粉菌种MLST基因分型技术的建立

5．1 材料

5．1．1 标准菌株及样品菌株

5．1．2 仪器与设备

5．1．3 PCR扩增试剂

5．2 MLST PCR扩增和产物分析

5．3 MLST基因分型技术的建立

5．3．1 菌株电泳结果分析与测序序列比对

5．3．2 基于MLST基因分型技术的建立

5．3．3 基于MLST基因分型技术对样品分离菌株的鉴定

5．4 本章小结

第6章 总结与展望

6．1 总结

6．2 展望

参考文献

攻读硕士期间的科研成果

致谢

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