酪蛋白源新型抗高血压活性肽的分离、纯化及其生理活性和结构鉴定

摘要

近年来，随着人们生活水平的提高，高血压的发病率也呈上升趋势，全世界大约有20％的成年人受此威胁，因此，源于食品抗高血压肽的保健功能研究愈加引起广泛关注。 酪蛋白是牛乳中的主要蛋白质，结构比较开放、松散，易受多种蛋白酶的作用而发生水解。本实验选用食品级微生物蛋白酶A和B分别水解酪蛋白，而且水解时产生较多的切割位点，可以达到较高的水解度。通过改变酶的浓度进行水解，水解效果较好，水解度达到20％以上，水解后形成的肽段的平均含有2—5个氨基酸残基，但水解后样品中的灰分含量较高，一般为14％左右，严重影响了水解样品的品质和活性的分析研究，必需进行脱盐处理。同时水解物进行RP-HPLC分布的结果显示酪蛋白水解后形成很多肽的混合物，成分复杂，需要进一步分离纯化。 采用大孔吸附树脂对蛋白溶液进行脱盐处理行之有效的方法。本实验通过筛选利用DA-201C对酪蛋白酶解液的脱盐是最佳的，而且70％乙醇溶液为洗脱剂时洗脱率和脱盐率均较高，而且水解样品经脱盐处理后大部分的ACE抑制活性升高，特别是8号样品脱盐后的活性升高幅度较大，达到80.1％，并且RP-HRLC检测，脱盐后达到了脱盐和纯化的目的，但是其中的成分还是很复杂。 利用8号脱盐样品两种浓度(高剂量1000mg／kg；低剂量500mg／kg)对SHR大鼠灌胃，6小时内降压效果强烈；1000mg／kg的剂量对SHR大鼠有极显著的降压效果，500mg／kg的剂量亦对SHR大鼠有显著的降压效果。因此8号脱盐样品在体外有较强的ACE抑制活性，在体内动物实验也具有较强的抗高血压活性，表明脱盐后样品为含有抗高血压活性肽的混合物。 采用分子排阻的凝胶色谱、RP-HPLC方法对8号脱盐样品进行分离纯化，经SephadexG-15分离后显示6个分离组分峰，并分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ，其中8—Ⅴ和8-Ⅵ组分具有较强的ACE抑制率，分别达到72.6％和75.5％，因此将对8—Ⅴ和8—Ⅵ作进一步分析与分离。经RP-HPLC检测分析，8—Ⅵ组成成分复杂，而8—Ⅴ峰样品在检测波长220nm和280nm都显示主要两个组分峰，分别为P1和P2，其氨基酸组成中含有芳香族氨基酸。检测P1和P2组分对ACE活性抑制率，分别达到84.4％和79.6％，采用RP—HPLC检验纯化效果，这两个组分都只含有一种肽。 在体外检测活性的基础上，采用8—Ⅴ号样品(<5mg／mL)对SHR大鼠灌胃(<5mg／kg)，测量同一天不同时间点大鼠的SBP，在4小时和8小时内降压效果强烈，以后大鼠血压渐渐升高趋势，8—Ⅴ号样品在连续9天灌胃SHR大鼠后SBP的的测量结果，统计结果样品组和对照组比较有极显著差异(P＜0.01)，说明8-V所含有的两个组分Pl和P2是具有较强作用的抗高血压活性肽。采用LC-ESI-MS对8-V样品进行分子量和序列的初步分析，在此基础上又通过MA-LDI-TOP-TOP-MS和N-端氨基酸序列仪对8-V-P1和8-V-P2进行分子量和序列的进一步确定，8-V样品进入HPLC分离结果，主要峰为P1和P2，分别选择P1和P2进行质谱鉴定和高级分析软件Biolynx分析，软件推导氨基酸序列P1为A1-A2；P2为B1-B2-B3或C1-C2-C3-C4，经过与酪蛋白序列比对，序列C1-C2-C3-C4在CN中不存在。进一步通过MALDI-TOP-TOP-MS和N-序列检测结果与分析得出8-V-P1为A1-A2，8-V-P2为B1-B2-B3，利用生物信息学网上查找和大量资料的查阅对比，没有找到序列相同的抗高血压肽，因此该两种肽为新型抗高血压肽。 总之，本研究以酪蛋白为原料通过微生物蛋白酶降解后，分离纯化得到两种新型抗高血压活性肽，同时建立体内和体外功能检测模型跟踪其对ACE抑制活性和抗高血压效果，并进行多肽的分子量和一级结构的测定，为食品蛋白质的开发利用和多肽药物的研究奠定理论和实验依据。

目录

文摘

英文文摘

第一章绪论

第二章微生物蛋白酶水解酪蛋白的研究

第三章酪蛋白酶解液脱盐及生理活性检测

第四章抗高血压活性肽的分离纯化过程

第五章抗高血压活性肽的一级结构检测与分析