应激状态下的星形胶质细胞对神经元对抗谷氨酸神经毒性作用

摘要

目的：星形胶质细胞在神经系统有许多重要的作用.其中,中风后对神经元起保护作用是其功能之一. 在本实验中,模拟脑损伤后重要的危害因素之一的高谷氨酸状态在体外纯星形胶质细胞培养中的作用,观察星形胶质细胞对谷氨酸诱导的神经元损伤的保护作用极其可能机理. 材料和方法:分别体外培养单纯神经元和神经胶质细胞;在神经胶质细胞培养基内加入谷氨酸,将刺激后的条件培养基应用于纯神经元细胞培养基中,用Alamar Blue法检测神经元的死亡情况;应用分光光度法测定加入谷氨酸后星形胶质细胞培养基内丙酮酸的浓度,以及外源性给予神经元丙酮酸观察其对抗谷氨酸毒性作用;高压液相色谱法检测谷氨酸作用后神经元内谷胱甘肽的相对值;用reall-timeRTPCR检测加入丙酮酸的神经元内谷胱甘肽合成限速酶GCSmRNA表达情况. 结果：用400μM谷氨酸处理过30min,洗去后,再用初始神经元细胞培养液(无星形胶质细胞培养基)培养24hr后,神经元细胞的平均细胞抑制率是39.66±2.59﹪.用相同剂量谷氨酸处理神经元细胞30min后,并换上按各种比例混合的培养基(条件神经胶质细胞培养基占培养基总量比) (12.5﹪,25﹪,50﹪,75﹪,100﹪),培养24hr后,神经元细胞的细胞抑制率下降至20.60±7.76﹪,3.13±1.22﹪,3.80±2.06﹪,10.05±2.08﹪,7.82±5.0﹪,与单纯用谷氨酸的神经元细胞抑制率相比,均低于对照组P<0.01;当谷氨酸加入到不含有丙酮酸的神经胶质细胞培养基后,丙酮酸的浓度迅速增至0.203±0.009EM.其峰值大约在30和60min(0.225±0.016和0.200±0.008mM).然后,在360min内,丙酮酸的浓度下降至0.090±0.022mM; 当谷氨酸作用时及以后给予外源性丙酮酸后,某些浓度丙酮酸(1mM)能使神经元细胞的细胞抑制率下降(8.69±5.87﹪).但不是所有浓度的丙酮酸都有这个作用.低浓度的丙酮酸(0.2,0.5mM)不能保护神经元(p=0.14,0.13);Real-time定量RT-PCR,通过每组样本的荧光阈值数据,检测到在谷氨酸和丙酮酸处理过的样本中,其神经元内GCS mRNA逐渐增加,较对照组高2.48±0.36.谷氨酸单独作用组增加约1.13±0.46,但丙酮酸单独作用组反而较未处理时下降.30min内,丙酮酸和谷氨酸处理组,谷氨酸、丙酮酸单独处理组较对照组增高约1.46±0.25,0.03±0.46,1.40±0.22(p<0.05);用谷氨酸处理过的神经元内内源性GSH的量较对照组略下降.尽管单独用外源性丙酮酸可以增加胞内GSH,但只有1.2倍.但当在谷氨酸处理时加入丙酮酸并维持30min后,GSFI的水平较对照组升至两倍左右.BSO(0.1mM)作用过24hr的神经元细胞存活率为93.99±1.96﹪(p<0.05).单纯加入低浓度的丙酮酸(1,2.5 mM)无毒性作用,但加入丙酮酸和BSO混合物后,细胞大量死亡(细胞抑制率为87.16±3.16﹪,78.97±2.15﹪,p<0.005).处理后3hr内,几乎半数的神经元细胞死亡.在BSO和丙酮酸中的神经元的细胞抑制率呈剂量相关性.丙酮酸剂量增大,细胞抑制率上升. 结论：在体外实验中一定浓度的谷氨酸可刺激神经胶质细胞的培养基具有更强的保护神经元的能力;丙酮酸是星形胶质细胞向神经元传递的物质并参与了神经元细胞的抗谷氨酸作用;丙酮酸保护神经元对抗谷氨酸毒性作用的机理之一是增加了神经元内抗氧自由基的GSH合成中重要的限速酶GCSmRNA表达,从而促进GSH的合成.

目录

文摘

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绪论

材料和方法

1.神经元细胞原代培养

2.神经星形胶质细胞培养

3.准备应激胶质细胞培养基

4.观察细胞的存活率：MTT法和Alamar Blue染色法

5.神经胶质细胞条件培养基对神经元的保护作用

6.丙酮酸量的测定：

7.外源性丙酮酸对神经元对抗谷氨酸的毒性作用

8.GCSmRNA定量测定：Real-Time RT-PCR法

9.HPLC assay：HPLC分析：

10.外源性GSH对神经元的作用

11.去除GSH后，丙酮酸对神经元细胞的毒性

12.Statistics统计

结果：

1.神经元细胞在谷氨酸应激下的存活力：

2.应激星形胶质细胞培养基中释放了更多的丙酮酸

3.丙酮酸对谷氨酸诱发的神经毒性的保护作用

4.谷胱甘肽合成酶(GCS)mRNA的表达

5.神经元细胞内还原型谷胱甘肽的水平

6.外源性GSH对神经元的作用

7.去除GSH后,丙酮酸对神经元细胞的毒性

讨论

结论：

参考文献：

综述 神经星形胶质细胞与神经元间能量物质传达递及保护作用

致谢

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