肺腺癌骨转移动物模型的建立及针孔SPECT显像在模型建立中的应用

摘要

目的:1.建立稳定的人肺腺癌裸鼠移植瘤骨转移模型。2.分析模型建立过程的关键影响因素。3.探索在体外条件下分离、传代、扩增人肺腺癌细胞株SPC-A-1的方法原理。 4.研究放射性核素99mTc-MDP和X线摄片放射性剂量对骨转移细胞培养及染色体变化的影响。5.对比分析针孔SPECT在建立骨转移动物模型过程中的应用前景。6.初步分析SPC-A-1BM细胞的染色体及VEGF mRNA表达。 方法:1.选取肺腺癌细胞株SPC-A-1，在体外传代扩增至一定数目，然后选择两组裸鼠，将肺腺癌细胞株分别接种于左心室和肺原位，在相同条件下观察两组裸鼠体内移植瘤的生长情况。2.对SPC-A-1细胞进行“接种-扩增-接种”循环周期共10次。3.分别用针孔SPECT（GE，Millennium VG，USA，d=1mm）与X线摄片（40Kv、2mA、6s)对裸鼠骨转移情况进行检测：将SPC-A-1细胞分成七组，即X线组和按接受99mTc-MDP放射性剂量大小的不同分成的六个实验组（分别为空白对照组、37MBq、74MBq、111MBq、370MBq、740MBq组)，每组再按不同的照射时间分为4、8、12、24、48、72、96h各一瓶，每天同一时间记录细胞量的改变。4.在无菌条件下采集骨转移细胞，离心后接种培养传代扩增，接种-扩增-接种循环10次。5.在上述10次循环周期中的后四个周期中，从接种细胞第三周开始，每两周处死一组裸鼠，摘取肺、肝、肾等器官并进行固定、石蜡包埋、连续切片及H&E染色，显微镜下观察各脏器肿瘤转移情况。6.将上述经10次循环周期后得到的细胞进行染色体G带分析，对亲代细胞SPC-A-1及培养所得的SPC-A-1BM细胞染色体数量及形态变化进行比较。应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) 方法，检测SPC-A-1BM细胞中VEGF mRNA的表达。 结果：1.SPC-A-1细胞经过重复“接种-扩增-接种”循环10次后,获得了高亲骨特性的肺腺癌细胞SPC-A-1BM。2.对裸鼠左心室接种后的骨转移检出率达100％,对裸鼠肺原位接种后的骨转移检出率约达60％。3.与111MBq组相比，37 MBq组和X线组的细胞数量差异并无统计学意义(F=7.93，P=0.693；F=5.60，P=0.780)，而且，111MBq组的显像时间提前，效果清晰。此外，111MBq剂量组对小鼠疑似骨转移灶的细胞培养成功率达81.5％，远高于X线组的13.3％。4.裸鼠接种SPC-A-1BM细胞后，在整个实验观察过程中，肉眼及镜下均未见肝脏、肾脏部位的转移灶。但后四个传代-接种周期中，在左心室接种组，肾上腺、颌下腺和淋巴结均见转移,转移率分别为100％，100％，56.3％；而于肺原位接种组，肾上腺、颌下腺均未见转移，只是对侧肺及淋巴结转移部位的转移率分别达到了100％，40.6％。同时数据还显示，两接种组的各组织转移率差异均有统计学意义（P=0.016）5.对亲代细胞及SPC-A-1BM细胞进行染色体的分析结果表明，SPC-A-1BM细胞的多倍体数显著增多，显示出其不稳定性比亲代增加。此外，分析结果还表明 SPC-A-1BM细胞的染色体数目及形态改变较亲代细胞多。6. 与SPC-A-1细胞相比，SPC-A-1BM细胞的VEGF-B、VEGF-C及VEGF-D mRNA表达上调，而VEGF-A mRNA表达下调。 结论：1.本课题成功建立了肺腺癌裸鼠移植瘤骨转移模型。2.深入分析了影响该骨转移模型能否建立的关键因素。3.初步证明了针孔核素显像在肺腺癌骨转移动物模型建立中的应用价值。4.证明了SPC-A-1BM细胞的促血管生成能力明显要强于SPC-A-1细胞。5.本课题建立的动物模型不仅为探寻肺腺癌骨转移的早期诊断与治疗方法奠定了坚实的基础，也对研究介导骨转移的相关基因具有启迪作用。