杜氏利什曼原虫两个发育阶段基因表达系列分析文库的构建及HSP90在其阶段转变过程中的作用

摘要

利什曼原虫可在人体导致多种疾病，是对人体危害严重的人兽共患寄生虫病，其中最致命的是由杜氏利什曼原虫引起黑热病。杜氏利什曼原虫生活史有前鞭毛体及无鞭毛体两个时期。利什曼原虫由前鞭毛体向无鞭毛体的转变过程是一个复杂的包括形态学及生理学的改变。这一过程中发生的改变不仅导致前鞭毛体形态上的变化，还使其逃避了宿主巨噬细胞的杀伤存活下来。目前为止，各阶段疫苗都为利什曼原虫病的防治发挥着作用，但各阶段疫苗都存在缺陷。本研究以体外培养的前鞭毛体及无鞭毛体为研究对象，引入基因表达系列分析的方法，建立这两个发育阶段基因表达系列分析文库，希望为进一步的探讨其转化机制，以及转化过程与宿主的关系提供更多的线索。本研究主要内容如下： ㈠改进了杜氏利什曼原虫MHOM/CN/Gansu-8801种无外源细胞污染的无鞭毛体体外培养的方法，得到了大量的无鞭毛体供后续研究。接下来，我们应用基因表达系列分析(SAGE)的方法建立了杜氏利什曼原虫前鞭毛体及无鞭毛体两个发育阶段基因表达文库。一共获得总标签数为40,431个，在前鞭毛体文库和无鞭毛体文库中分别为20,299和20,132个标签。大约89％的基因在两个文库中均有表达，有968个基因的表达水平在两个文库之间有显著性差异。其中，326个基因在无鞭毛体文库中是表达下调的，642个基因表达上调。我们选取了两个文库中表达差异较大的标签，BLAST查找比对找到28个标签与其对应的基因，这其中包括histone4，elongation factor1-alpha，alpha tubulin，acidicribosomal protein，LACK，ubiquitin-fusion protein，40S ribosomalprotein S2，40S ribosomal protein S33，60S nbosomal protein121，60Sribosomal protein L28等基因。在这其中，延长因子1-alpha和LACK基因已经用于制备多克隆抗体，做为新的抗利什曼原虫药物和疫苗研究的候选基因。而其它表达差异显著的基因也有可能成为新的药物靶标。用实时定量PCR的方法选取了7个基因对SAGE的结果进行了验证，结果表明实时定量PCR与SAGE所揭示的基因在杜氏利什曼原虫两个发育阶段表达变化是一致的。 ㈡在培养无鞭毛体的过程中，发现有研究报道用HSP90的特异性抑制剂葛尔德霉素(GA)可以在室温和碱性条件下诱导利什曼原虫前鞭毛体转变为无鞭毛体，而仅仅在碱性条件下提高培养温度到37℃又可以诱导前鞭毛体发生凋亡。因此，我们观测了HSP90特异性抑制剂GA在利什曼原虫前鞭毛体向无鞭毛体转化过程中的作用，在温度升高的条件下，GA抑制HSP90后会诱导前鞭毛体凋亡还是发生阶段转变?期望找到更多关于HSP90在这一转化过程中的作用的证据及其发挥作用的可能途径。结果发现，用GA处理后的细胞在光学显微镜下和扫描电镜下观察可见体积变小、细胞膜完整但出现发泡现象、染色质浓缩、边缘化，核膜裂解等典型的凋亡形态。用TUNEL原位末端标记法处理细胞后，在激光共聚焦显微镜下可以直观看到细胞有明显的绿色荧光的阳性凋亡信号，并随时间增加而增多。用TUNEL法经流式细胞仪检测细胞发生凋亡的情况及比例，结果显示，GA诱导杜氏利什曼原虫前鞭毛体在阶段转变过程中发生凋亡这一作用呈时间和剂量依赖性。我们用PI染色后，通过流式细胞仪分析了GA对杜氏利什曼原虫细胞周期的影响，GA处理24h后细胞阻滞于G0/G1期，伴有S期减少，并出现明显的凋亡峰。用PI染色分析细胞凋亡情况，结果与TUNEL法检测凋亡结果一致。 ㈢研究结果表明，GA可以诱导杜氏利什曼原虫前鞭毛体在阶段转变过程中发生凋亡和细胞周期改变。检测处理前后细胞内ROS和GSH水平变化后发现，GA对杜氏利什曼原虫前鞭毛体在阶段转变过程中的存活和分化的影响与其引起的ROS含量上升和GSH含量下降有关，而提高细胞内GSH水平可抑制其毒性作用。GA诱导杜氏利什曼原虫前鞭毛体发生凋亡这一作用可能是跟GA引起细胞线粒体功能障碍有关。进一步说明HSP90在细胞阶段转变中发挥着重要作用。我们还比较了不同培养基pH值在GA诱导利什曼原虫凋亡的过程中的影响，发现酸性环境可能有利于细胞存活。同时我们还选择了5个SAGE文库结果中表达差异显著的基因，检测了在GA处理的过程中这些基因的表达水平变化情况。用实时定量PCR方法分析发现GA可以影响基因表达变化，ATPase subunit9和Ubiquitin-fusion protein h的表达量均明显增高，而Elongation factor1-α和H3的表达量是降低的。Ribosomal subunitprotein L31的表达量却无明显变化。相关性分析结果显示，Elongationfactor1-α和H3的表达量与细胞凋亡比例之间有相关性。提示这两个基因在GA诱导的细胞凋亡过程可能发挥一定作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

第1章综述

1.杜氏利什曼原虫简介

(1)利什曼原虫介绍

(2)杜氏利什曼原虫生活史

(3)利什曼原虫入侵巨噬细胞的机制

(4)两种发育阶段的转化机制

(5)利什曼原虫疫苗的研究现状

2.功能基因组学及其研究方法概述

(1)功能基因组学的主要研究内容

(2)功能基因组学的主要研究方法

(3)小结

3.基因表达系列分析及其在寄生虫研究中的应用

(1)SAGE技术基本流程、原理，特点

(2)与基因芯片等技术的比较

(3)SAGE技术的改进和发展

(4)SAGE标签的提取分析比较和未知标签的鉴定

(5)SAGE与其它技术的联用

(6)SAGE在寄生虫学研究中的应用概况

(7)小结与展望

4.热休克蛋白、活性氧与细胞凋亡的关系

(1)热休克蛋白与细胞凋亡

(2)ROS和线粒体功能

第2章杜氏利什曼原虫无鞭毛体的培养及两个发育阶段基因表达系列分析文库的建立

1.引言

2.材料和方法

(1)材料与试剂

(2)实验方法

3.结果

(1)利什曼原虫无鞭毛体的培养

(2)利什曼原虫形态学鉴定

(3)RNA提取

(4)SAGE文库的建立过程及其质量监测

(5)SAGE文库结果分析

4.讨论

5.小结

第3章HSP90抑制剂葛尔德霉素在利什曼原虫阶段转变中的作用

1.引言

2.材料和方法

(1)材料与试剂

(2)实验方法

3.结果

(1)GA可以诱导杜氏利什曼原虫前鞭毛体凋亡

(2)GA对杜氏利什曼原虫细胞周期的影响

(3)GA对杜氏利什曼原虫细胞内ROS水平和GSH浓度的影响

(4)抗氧化剂可降低GA诱导的细胞凋亡比例

(5)pH在GA诱导利什曼原虫凋亡中的作用

(6)实时定量PCR分析基因表达水平结果

4.讨论

5.小结

第4章总结和展望

1.全文总结

2.后续研究工作展望

参考文献

附录

致谢

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