用慢病毒载体作为模型研究具有保护内含子作用的元件

摘要

在I型获得性免疫缺陷病毒（HIV-1）的生命周期中，病毒通过不同的剪接方式产生了40多种不同类型的mRNA,这些mRNA翻译出的功能蛋白能将完整的转录本重新包装成新的病毒。例如，Rev蛋白将完整长度的或是单一剪接的转录本转运出核。因此，必然存在一种协同的机制调控和保护着内含子的剪接。为了证实这一假设，我们利用带有内含子的慢病毒载体质粒制备了假病毒，并以此制备了病毒介导的转基因小鼠。我们发现，在这假病毒和转基因小鼠中均有内含子存在的现象。这激励我们尝试在CMV启动子与带有内含子DNA间插入一段病毒功能性片段构建了一系列载体，然后在添加与不加Rev质粒的情况下转染入293T细胞。通过提取细胞RNA，逆转录，实时荧光定量PCR的方法获得含有内含子的转录本与全部转录本的比值（I/E），并以此衡量病毒片段对内含子的保护能力。我们的结果表明Leader(包含了剪接功能域1和包装信号的片段)在与Rev共作用时，其I/E的比值达到90％左右。而删除了Leader的病毒质粒，则失去了保护内含子的作用。我们因此推断，Leader具有能够保护内含子不被剪切的功能，而Rev则起到协同作用。