食源性肠球菌荧光定量PCR检测方法的建立和评价

摘要

肠球菌（Enterococcus spp.）是引起食源性疾病的一种重要的条件致病菌，容易污染乳制品、肉制品等。由于其经加热等加工流程后仍能存在，因聚餐引发的肠球菌食物中毒事件常有发生。此外，该菌对多种抗生素特别是万古霉素具有高水平耐受性，其耐药性可通过食品链转移到人群，从而引发更大的食品安全隐患。因此，建立特异、灵敏和高效的检测方法对于肠球菌的监测与控制具有重要意义。
　　基于荧光定量PCR的检测方法具有特异、灵敏、快速并可以实现定量分析等优势，被广泛应用于食源性致病菌的检测。目前文献报道的肠球菌荧光定量PCR检测靶点主要是16S rRNA和23S rRNA，数量有限且序列保守性过强。采用此类靶点建立的PCR体系，容易出现假阳性结果。同时，PCR检测体系对食品样品检验效果的有效性评估也较为缺乏。因此，发掘新的特异性更强的检测靶点，并对PCR反应体系应用于食品样品检测时的效果作出评价是十分必要的。
　　本研究以基因组比对分析等生物信息学手段在肠球菌全基因组序列中发掘特异性靶点，以得到的36个候选靶点序列设计50对引物，结合普通PCR和荧光定量 PCR验证，最终筛选出一个特异性强、灵敏度高的检测靶点（EF1902），基于此靶点建立肠球菌荧光定量PCR检测方法。采用该方法对44株肠球菌和23株非肠球菌菌株进行检测，以肠球菌基因组 DNA为模板均能采集到特异性扩增信号，而以非肠球菌基因组DNA为模板时均无特异性扩增信号形成。在最佳反应参数（退火温度60℃、染料浓度1μL，引物浓度0.2μmol/L）下，荧光定量PCR方法的基因组DNA检测灵敏度可达13.78 copies/PCR，纯培养物灵敏度为38.4 cfu/PCR。对肠球菌人工污染牛奶样品的检测实验表明，当初始接菌量为2.63 cfu/mL时，只需增菌6 h即可用该方法检出肠球菌。通过对4大类（52份）食品样品进行PCR和传统活菌计数法检测的比较研究，发现本研究所建立的PCR方法准确率达到94.23％。
　　本研究结合生物信息学方法和PCR方法发掘针对肠球菌的特异性检测检测靶点，并以此为基础建立的肠球菌荧光定量PCR检测方法。该方法具有特异、灵敏、快速、准确的特点，有望广泛应用于食品中肠球菌的快速检测。

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英文缩略语索引

第一章 绪 论

1.1 肠球菌研究进展

1.1.1 肠球菌的分类及生物学特征

1.1.2 肠球菌的分布

1.1.3 肠球菌的危害性

1.2 肠球菌检测技术研究进展

1.2.1传统检测方法

1.2.2免疫检测方法

1.2.3 核酸探针检测方法

1.2.4 PCR检测方法

1.3 研究的目的与意义

第二章 肠球菌特异检测靶点的筛选及普通PCR验证

2.1 材料

2.1.1 菌株

2.1.2 培养基及主要试剂配方

2.1.3 主要仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 DNA提取及纯度分析

2.2.2 检测靶点的发掘及引物设计

2.2.3 普通PCR反应及电泳检测

2.2.4 特异性评价

2.2.5 PCR产物测序验证

2.2.6 灵敏度评价

2.3 结果与分析

2.3.1 检测靶点的挖掘

2.3.2 普通PCR特异性评价

2.3.3 普通PCR产物验证

2.3.4 灵敏度评价

2.4 讨论

第三章 肠球菌荧光定量PCR检测方法的建立和评价

3.1 材料

3.1.1 菌株

3.1.2 培养基及主要试剂配方

3.1.3 主要仪器设备

3.2 实验方法

3.2.1 荧光定量PCR体系特异性评价实验

3.2.2 荧光定量PCR体系优化

3.2.3 灵敏度评价

3.2.4人工污染食品样品实验

3.2.5食品样品检测

3.2.6 荧光定量PCR方法的定量准确性评价

3.3 结果

3.3.1 特异性评价实验

3.3.2 荧光定量PCR反应体系优化

3.3.3 灵敏度评价

3.3.4人工污染食品样本实验

3.3.5 食品样品的检测

3.3.6 荧光定量PCR方法的定量准确性评价

3.4 讨论

第四章 总结与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文