O-糖基转移酶新亚家族的功能性质研究及酶底物筛选法的建立

摘要

糖基化是细胞内重要的翻译后修饰过程，细胞内有超过50％的蛋白质可被糖基化。在许多生命过程中，糖链发挥了复杂的功能，如调节蛋白质折叠与稳定、淋巴归巢、细胞黏连与迁移、宿主-病原体相互作用、免疫应答、生物体繁殖和胚胎形成等。
　　糖基化分为N-糖基化和O-糖基化两种，多肽:N-乙酰氨基半乳糖基转移酶(ppGalNAc-T, EC2.4.1.41)是催化粘蛋白型O-糖基化修饰起始的糖基转移酶。ppGalNAc-T是一个酶家族，每个成员都有不同的组织表达分布和底物特异性。本文研究了该酶家族的一个新亚家族—Y亚家族基因的生化特性及功能。Y亚家族由ppGalNAc-T8、-T9、-T17和-T18组成，与其它ppGalNAc-T相比，它们在氨基酸序列水平上存在一些重要的突变。遗传进化分析显示，Y亚家族基因仅存在于脊椎动物中，有趣的是，它们均失去了体外GalNAc转移活性。对Y亚家族新成员ppGalNAc-T18的模拟结构分析表明UDP-GalNAc结合位点的突变可能是导致Y亚家族酶失去催化活性的原因。另外，本文证明ppGalNAc-T18定位于内质网而不是高尔基体。我们对Y亚家族酶的功能进行了探讨，虽然还没有得到最后的结论，但其成员特殊的表达定位暗示了该亚家族在脊椎动物中发挥着重要的作用。
　　目前，ppGalNAc-T的底物研究是糖生物学领域的重要课题之一，它对揭示O-糖基化的功能具有重大意义。叠氮化糖基转移酶供体底物类似物标记是一种新的糖基化检测方法，叠氮基团可与炔基发生特异的Click反应，从而被标记炔基的荧光物质检测。该方法比常用的抗体或凝集素检测更加稳定且特异。本文结合叠氮化ppGalNAc-T供体底物类似物UDP-GalNAz检测手段和蛋白质芯片技术，利用可糖基化多肽芯片进行实验并优化实验条件，最终成功建立了基于蛋白质芯片的ppGalNAc-T底物高通量筛选方法，在16000个蛋白质中成功筛选出226个可能的ppGalNAc-T底物蛋白，其中包括转录因子、激酶、细胞内吞作用相关蛋白等。该筛选方法的建立为系统地筛选人类20种ppGalNAc-T的底物提供了有力手段，同时也为更好地揭示 ppGalNAc-T和O-糖基化在机体中所发挥的作用奠定了基础。
　　摘要多肽：N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-T)是催化 N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)结合到蛋白质 Ser或Thr上的糖基转移酶，是粘蛋白型O-糖基化修饰的起始糖基转移酶。ppGalNAc-T是一个酶家族，人类全基因组中共有20个成员，18个已被研究报道，其表达产物均为Ⅱ型膜蛋白。虽然氨基酸序列高度同源，但各成员具有其独特的底物特异性和动力学特征。因此，ppGalNAc-T的底物作用机制是O-糖基化研究领域中的关键课题。近年来，通过利用氨基酸位点突变及晶体结构解析技术，ppGalNAc-T中与底物相互作用的重要氨基酸残基以及由这些残基所形成的对底物结合起关键作用的空间构象逐渐被揭示，为了解ppGalNAc-T酶家族的底物作用机制及其蛋白结构与催化活性间的关系提供了理论依据。

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第一章 绪论

1.1 糖链

1.2 ppGalNAc-T酶家族研究进展

1.2.1 ppGalNAc-T酶的发现与克隆

1.2.2 ppGalNAc-T的蛋白结构

1.2.3 ppGalNAc-T的催化活性

1.2.4 ppGalNAc-T的亚细胞定位及功能

1.3 糖基转移酶供体底物叠氮化类似物研究进展

1.4 蛋白质组芯片

1.5 本论文的主要研究工作

第二章 O-糖基转移酶新亚家族的功能性质研究

2.1 引言

2.2 材料和方法

2.2.1 材料

2.2.2 方法

2.3 结果

2.3.1 Y亚家族的遗传进化分析

2.3.2 Y亚家族的酶活测定

2.3.3 ppGalNAc-T18蛋白模拟三维结构分析

2.3.4 ppGalNAc-T18的亚细胞定位

2.3.5 ppGalNAc-T18的生物学功能

2.4讨论和结论

第三章 基于蛋白质芯片的ppGalNAc-T底物高通量筛选方法的建立

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.2.1 材料

3.2.2 方法

3.3 结果

3.3.1基于多肽芯片的ppGalNAc-T酶活反应及检测预实验

3.3.2基于多肽芯片的ppGalNAc-T酶活反应及检测条件的优化

3.3.3 Biotin 标记多肽的ppGalNAc-T酶活反应及检测

3.3.4 基于人蛋白质组芯片的ppGalNAc-T底物蛋白筛选

3.4讨论及结论

第四章 全文总结与展望

参考文献

综述：O -糖基化起始糖基转移酶的活性与结构研究

致谢

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文

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