慢性乙型肝炎肝纤维化非创伤性诊断及肝纤维化进展的机制研究

摘要

第一部分HBeAg阴性慢性乙型肝炎肝纤维化非创伤性诊断模型的建立和应用评价
　　目的:在HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者中建立基于常规实验室指标的肝纤维化非创伤性诊断模型，并评价其诊断肝纤维化的价值，为肝纤维化临床诊断和疗效评价提供依据。
　　方法:将349例具有肝活检的HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者随机分为建模组(n=200)和验证组(n=149)。在建模组中，采用Logistic回归和受试者操作特征(ROC)曲线等方法建立诊断模型预测显著性肝纤维化（S2-S4）和早期肝硬化(S4)。在验证组中，用ROC曲线等方法评价和比较该模型、APRI指数、Forns指数、S指数和FIB-4模型的诊断价值。
　　结果:在建模组中，将年龄、性别、凝血酶原时间、血小板计数、γ-谷氨酰转移酶及胆固醇这6个指标联合起来建立诊断模型。它能准确的预测HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者有无显著性肝纤维化和早期肝硬化，建模组ROC曲线下面积分别达到0.856和0.956。基于ROC曲线，预测有无显著性肝纤维化时，取0.22为阴性界值，0.75为阳性界值;预测有无早期肝硬化时，取0.95为阴性界值，0.98为阳性界值，能达到较好的诊断效果。相应的在验证组中，该模型预测有无显著性肝纤维化和早期肝硬化的ROC曲线下面积分别为0.889和0.937，优于其他国内外模型。使用建模组所得到的界值，可以准确的预测40.9％的HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者有无显著性肝纤维化及91.3％的患者有无早期肝硬化。
　　结论:该模型能够准确的区分HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者有无显著性肝纤维化及早期肝硬化，减少临床实践中肝活检的需要，具有较好的临床应用前景。
　　第二部分慢性乙型肝炎进展中的差异基因表达谱研究
　　目的:应用基因芯片技术检测不同炎症阶段的慢性乙型肝炎患者肝组织的基因表达谱，筛选与慢性乙型肝炎炎症进展相关的差异基因，对其进行生物信息学分析，探讨慢性乙型肝炎进展相关的分子机制。
　　方法:收集189例不同炎症阶段(G0-G4)的慢性乙型肝炎患者肝活检组织，Trizol一步法抽提总RNA。采用1％琼脂糖凝胶电泳和芯片实验室(Lab-on-chip)检测RNA质量。使用QIAGENRNeasyKit进一步纯化总RNA和cRNA。采用人类全基因组微阵列AffymetrixU133Plus2.0GeneChip检测，应用GeneSpring软件对显著差异基因、聚类、基因功能和信号通路进行分析。采用实时荧光定量PCR技术对其中5个差异基因的表达水平变化进行验证和分析。
　　结果:1％琼脂糖凝胶电泳和Lab-on-chip电泳结果均提示抽提的总RNA质量高，无降解现象。实验结果符合AffymetrixU133Plus2.0基因芯片质量控制标准，信号强度达到要求，检测系统无异常，从而保证了杂交结果的可靠性。差异基因聚类分析结果显示基因表达谱和病理学肝炎分级具有很好的相关性。将G1-G4组分别和G0组进行比较，共筛选出570个显著差异基因（P＜0.05）。G4/G0组间差异倍数≥2的上调和下调基因共212个，主要是3大类功能基因（炎症和免疫反应相关的基因占40.68％，信号转导相关基因和结构分子相关基因各占10.17％。信号通路分析结果显示有120条信号通路显著活化（P＜0.05），其中28条信号通路极显著活化(P＜0.001)，包括自然杀伤细胞介导的毒性相关的信号通路、T细胞受体信号通路和B细胞受体信号通路等。生物信息学分析显示Jak-STAT通路处于通路网络的核心位置，而CXCL10、STAT1、CCR2、CXCR4等是信号通路间关联的关键基因。Real-timePCR验证结果和基因芯片所得数据相一致。
　　结论:慢性乙型肝炎的发生和发展是一个复杂的病理过程，涉及诸多基因的表达变化，单一基因或信号通路不足以解释其分子机制的全貌。采用基因芯片技术高通量、高效率的筛选炎症进展过程中差异表达的基因，对这些基因进行系统的分析研究有助于阐明慢性乙型肝炎的发生机制、指导治疗和评估预后。
　　第三部分视黄醇脱氢酶13(Rdh13)基因敲除对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的作用及其机制研究
　　目的:本研究采用RdhJ13基因敲除小鼠来研究Rdh13在四氯化碳诱导的肝纤维化过程中的作用及其机制。
　　方法:本研究所用的野生型和Rdh13基因敲除小鼠均为8-10周龄的129/Sv和C57BL/6杂交系小鼠。以四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤和慢性肝损伤所致肝纤维化模型。检测肝脏的组织学和肝纤维化的关键标志物。在四氯化碳损伤后不同时间点，应用Real-timePCR、WesternBlot和免疫组化方法检测小鼠肝组织肝星状细胞活化标记α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、(Ⅰ)型胶原、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、血小板源性生长因子(PDGF)和一些细胞黏附分子（细胞间黏附分子-1，血管细胞间黏附分子-1和纤维连接蛋白）的表达情况。
　　结果:CC14急性肝损伤在野生型和Rdh13基因敲除小鼠都建立了一个促肝纤维化发生的环境，包括肝星状细胞的激活，Ⅰ型胶原、TIMP-1、主要的促纤维化分子(TGF-β1，PDGF)及细胞黏附分子(ICAM-1，VCAM-1，fibronectin)的表达上调。而且与Rdh13基因敲除小鼠相比，该反应在野生型小鼠中更剧烈。CC14慢性肝损伤后，野生型和Rdh13基因缺失小鼠肝纤维化模型均成功建立。但是，与Rdh13基因敲除小鼠相比，野生型小鼠的肝纤维化程度较高，与之相伴随的是肝星状细胞激活的数量和胶原沉积较多，TIMP-1、TGF-β1、PDGF及细胞黏附分子表达上调较多。
　　结论:在四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型中，Rdh13缺失减轻肝纤维化程度，抑制肝星状细胞的活化，促进胶原的降解，提示Rdh13基因敲除可能对肝纤维化有保护作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 HBeAg阴性慢性乙型肝炎肝纤维化非创伤性诊断模型的建立和应用评价

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．2．1 材料

1．2．2 方法

1．3 结果

1．3．1 研究对象一般特征

1．3．2 常规指标与显著性肝纤维化的关系

1．3．3 常规指标与早期肝硬化的关系

1．3．4 基于常规指标联合建立肝纤维化的预测模型

1．3．5 临界值的选取

1．3．6 各个非创伤性诊断模型的验证和比较

1．4 讨论

参考文献

第二部分 慢性乙型肝炎进展中的差异基因表达谱研究

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 材料

2．2．2 方法

2．3 结果

2．3．1 研究对象一般特征

2．3．2 总RNA抽提质量检测

2．3．3 基因芯片检测结果

2．3．4 Real-time PCR验证结果

2．4 讨论

参考文献

第三部分 视黄醇脱氢酶13(Rdh13)基因敲除对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的作用及其机制研究

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 材料

3．2．2 方法

3．2．3 统计学分析

3．3 结果

3．3．1 Rdh13基因敲除小鼠CCl4诱导的肝纤维化程度较轻

3．3．2 Rdh13基因敲除对CCl4刺激后小鼠肝组织中Ⅰ型胶原的影响

3．3．3 Rdh13基因敲除对CCl4刺激后肝星状细胞持续激活的影响

3．3．4 Rdh13基因敲除降低了CCl4刺激后小鼠肝组织中TIMP-1的上调水平

3．3．5 Rdh13基因敲除对纤维化过程中关键细胞因子的影响

3．4 讨论

参考文献

致谢

攻读博士学位期发表的学术论文和科研成果