阴沟肠杆菌在人体代谢综合征中的作用研究

摘要

近十几年来，肥胖及其相关的代谢性疾病已经成为世界范围内普遍流行的疾病，逐渐成为威胁人体健康的主要因素。研究表明，饮食和生活习惯的改变可能是导致现代社会代谢性疾病大范围流行的原因，而肠道菌群可能是连接在高能量的摄入和肥胖等代谢性疾病的发生之间的重要桥梁。研究表明，在所有可能的机制中，人体肠道中革兰氏阴性菌产生的内毒素脂多糖能够影响宿主的代谢和引起炎性反应，被认为在肥胖等代谢性疾病发生发展的过程中起着关键的作用。然而，到目前为止，还没有研究能够直接证明内毒素产生菌同这类疾病之间的因果关系。
　　 本研究中，我们发现一类内毒素产生菌——肠杆菌属，在一位肥胖患者肠道内过度生长（16SrRNA克隆文库结果显示其比例为35％）。经过23周严格的膳食干预后，该志愿者肠道中肠杆菌属的数量降到了检测不到的水平，同时该志愿者的体重下降了51.4kg(初始体重174.8kg)，高血压、高血糖、高血脂等症状均明显改善。元基因组测序分析表明该患者肠道内的内毒素合成基因的丰度明显下降。同时伴随着系统炎症水平的改善，血清中标志内毒素载量水平的脂多糖结合蛋白也明显下降。上述分析结果提示肠杆菌这类内毒素产生菌的过度生长可能与宿主发生代谢紊乱密切相关。为了验证该假设，我们采用序列引导的方法从该志愿者的粪便样品中分离获得一株内毒素产生菌——阴沟肠杆菌B29，用于后续的动物实验研究。
　　 首先，我们发现从这位极端肥胖志愿者肠道中分离得到的这株内毒素产生菌能够引起无菌小鼠发生肥胖和胰岛素抵抗。雄性C57BL/6J无菌小鼠接种了B29以后，在饲喂高脂饮食的条件下，出现了显著的肥胖和胰岛素抵抗表型，构成了悉生肥胖小鼠模型，而无菌对照小鼠能够抵抗高脂饲料诱导的肥胖发生。这种肠杆菌B29菌株诱导的悉生肥胖小鼠，血清中的内毒素载量以及系统性炎症因子水平均显著升高。进一步，定量PCR结果表明，菌株B29同时能够促进悉生肥胖小鼠肝脏和脂肪组织的炎性因子以及脂肪合成相关基因的表达。
　　 其次，我们发现内毒素产生菌诱导的悉生肥胖小鼠同时也具有非酒精性脂肪性肝病的症状。肝脏病理切片结果表明，饲喂高脂饮食同时灌胃B29菌株的悉生肥胖小鼠，肝脏的脂肪化程度最严重，同时伴有轻度的脂肪性肝炎症状，而其余各组小鼠基本没有非酒精脂肪性肝病的症状。NAFLD活动度积分(NAS)评估结果也显示，悉生肥胖小鼠的肝脏已经达到了非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的程度。血清肝功能指标AST和ALT的结果也同样支持病理切片的结果，同时，该组小鼠血清中的甘油三酯和总胆固醇的水平也显著高于其他各组小鼠。小鼠肝脏全基因组表达谱芯片检测结果表明，有34个基因在悉生肥胖小鼠和高脂饮食对照组小鼠之间的表达水平存在显著差异（其中24个基因的表达显著上升，10个基因的表达显著下降），在悉生肥胖小鼠肝脏中表达的上调程度最为显著的是同脂肪代谢和胰岛素抵抗密切相关的Cidea基因。
　　 综上所述，我们用一株人源内毒素产生菌成功建立了悉生肥胖小鼠模型，该悉生肥胖小鼠同时具有肥胖、胰岛素抵抗、血脂紊乱和非酒精性脂肪性肝病的症状，表明人体肠道内的内毒素产生菌可能是导致宿主发生这些代谢异常的重要原因之一，而不是代谢综合征发展的结果。本研究建立的方法可以在更多的人群中分离鉴定类似的内毒素产生菌，并通过本研究建立的悉生动物肥胖模型，能够深入研究这些肠道内毒素产生菌导致肥胖发生的作用机理。这类内毒素产生菌有可能会成为预防和治疗肥胖症及其相关疾病的新靶点。
　　 第二章一株来自肥胖患者肠道内的条件致病菌引起无菌小鼠肥胖
　　 无菌小鼠能够抵抗高脂饮食诱导的肥胖，表明肠道菌群在宿主的代谢综合征发展过程中起着重要的作用。给小鼠连续皮下注射低剂量的提纯的大肠杆菌菌株055∶B5内毒素，能够引起小鼠发生肥胖和胰岛素抵抗，表明脂多糖内毒素是目前为止，唯一已知的能够引起小鼠发生炎症，进而导致肥胖和胰岛素抵抗发生的细菌成分。尽管已有不少流行病学调查的数据表明，肥胖个体的肠道中内毒素产生菌的数量增加，血液中内毒素的水平也升高，但是，内毒素产生菌是否是肥胖发生的原因这个问题依然没有阐明。
　　 本研究中，我们用从一位极端肥胖志愿者肠道中分离的一株内毒素产生菌引发了无菌小鼠的肥胖和胰岛素抵抗症状。结果表明，经过23周严格的膳食干预后，该志愿者肠道中内毒素产生菌肠杆菌属的水平从35％下降到检测不到的水平，同时，该志愿者的体重下降了51.4kg（初始体重174.8kg），高血压、高血糖、高血脂等症状均明显改善。元基因组测序分析表明其肠道内内毒素合成基因的水平明显下降，同时血液检测结果表明其血清中内毒素载量水平也明显下降，炎症水平明显改善。我们将从该志愿者的粪便样品中分离得到的一株阴沟肠杆菌菌株B29接种给无菌C57BL/6J小鼠，发现该无菌小鼠在高脂饮食条件下表现出显著的肥胖和胰岛素抵抗表型，饲喂正常饮食的小鼠灌胃菌株B29后没有出现肥胖和胰岛素抵抗的症状，而饲喂高脂饮食的无菌对照小鼠最终也能抵抗高脂饮食诱导的肥胖发生。肠杆菌属菌株诱导的肥胖小鼠血清中的内毒素载量和系统以及局部组织的炎症水平均显著升高。
　　 本实验结果表明，人肠道内毒素产生菌具有诱发无菌小鼠发生肥胖和胰岛素抵抗的作用，提示肠道内高水平的内毒素产生菌是导致该个体极端肥胖发生的原因而不是结果。
　　 第三章阴沟肠杆菌菌株B29在非酒精性脂肪性肝病发展过程中的作用研究
　　 非酒精性脂肪性肝病已经成为世界范围内肝脏损伤的主要原因。目前已有一系列证据表明肠道菌群与非酒精性脂肪性肝病以及非酒精性肝炎密切相关，而在两者之间的相关关系中，内毒素脂多糖由于能够调节宿主代谢和炎性反应，在非酒精性脂肪性肝病的发生发展过程中发挥了重要的作用，然而，尽管如此，目前依然缺少实验证据证明内毒素产生菌是非酒精性脂肪性肝病发生发展的原因。本章中，我们对上一章建立的阴沟肠杆菌-悉生动物模型进行了非酒精性脂肪性肝病的研究。
　　 本研究中我们发现内毒素产生菌——阴沟肠杆菌B29引起的悉生肥胖小鼠同时也有非酒精性脂肪性肝病的症状。肝脏病理切片结果表明，HFD+B29组小鼠肝脏脂肪化程度较严重，并伴有轻度的非酒精性脂肪性肝炎。而其余各组小鼠几乎没有非酒精脂肪性肝病的症状出现。NAFLD活动度积分(NAS)评估结果也显示，HFD+B29组小鼠的肝脏已经达到了非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的程度。而其余各组小鼠几乎没有非酒精性脂肪肝的症状。血清肝功指标AST和ALT的结果也验证了病理切片的结果。上一章的研究我们发现，饲喂高脂饮食同时灌胃菌株B29（HFD+B29组）的小鼠体重以及各部位脂肪垫重量的增加最为显著，同时表现出胰岛素抵抗的症状。本研究中我们也通过血清生化指标测定，发现该组小鼠血脂水平显著高于其他各组。同时，通过小鼠肝脏全基因组表达谱芯片检测，我们找到了34个在模型小鼠及其高脂饮食对照之间差异表达的基因（24个基因表达上升，10个基因表达下降），其中上调最为显著的是同脂肪代谢和胰岛素抵抗密切相关的Cidea基因。
　　 本研究在内毒素产生菌和非酒精性脂肪性肝病之间建立了因果链，说明非酒精性脂肪性肝病是可以由肠道菌群直接参与引起的。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

引言

1．1 肥胖等代谢综合征概述

1．1．1 肥胖的基本概念

1．1．2 肥胖的流行病学调查

1．1．3 肥胖与慢性炎症

1．2 人体肠道菌群的结构与功能以及对人类健康的影响

1．2．1 人体肠道菌群的多样性组成

1．2．2 肠道菌群影响人体健康状态的作用概述

1．3 肥胖与肠道菌群关系的研究现状

1．3．1 肠道菌群与能量代谢和脂肪贮存

1．3．2 肠道菌群与系统性慢性低度炎症

1．4 非酒精性脂肪性肝病与肠道菌群关系的研究现状

1．4．1 非酒精性脂肪性肝病概述与诊断方法

1．4．2 非酒精性脂肪肝的流行病学调查及影响因素

1．4．3 非酒精性脂肪性肝病的发病机理

1．4．4 非酒精性脂肪性肝病与肠道菌群关系的研究进展

1．5 人体肠道菌群结构与功能的研究方法

1．5．1 基于分离培养的方法

1．5．2 基于指纹图谱的分子生态学研究方法

1．5．3 基于测序的分子生态学研究方法

1．5．4 多变量统计学在肠道菌群与健康相关研究中的应用

1．5．5 无菌动物在肠道菌群研究领域的应用

1．6 本章小结

参考文献

第二章 一株来自肥胖患者肠道内的条件致病菌引起无菌小鼠肥胖

摘要

引言

2．1 材料与方法

2．1．1 实验对象选择

2．1．2 膳食干预方案和生物样品采集

2．1．3 人体测量数据、临床数据实验分析以及生物样品分析

2．1．4 动物实验研究

2．1．5 粪便菌群的16S rRNA基因全长序列克隆文库分析

2．1．6 粪便菌群的变性梯度凝胶电泳分析

2．1．7 粪便菌群的元基因组测序及分析

2．1．8 “序列引导”的细菌分离

2．1．9 菌株ERIC-PCR指纹图谱分析

2．1．10 分离物的限制性内切酶酶切分型

2．1．11 菌株的利福平耐药标记

2．1．12 菌株生化鉴定以及16S rRNA基因全长序列的测定

2．1．13 菌株全基因组测序及草图分析

2．1．14 LPS提取以及检测

2．1．15 小鼠粪便菌落计数法分析粪便样品中代表菌株的数量

2．1．16 葡萄糖耐受实验

2．1．17 小鼠血清生化分析

2．1．18 实时定量PCR

2．1．19 细菌易位检测

2．1．20 数据统计分析

2．2 实验结果

2．2．1 肥胖患者膳食干预前后内毒素载荷量、炎性水平以及代谢综合征相关指标的变化

2．2．2 肥胖患者膳食干预前后肠道菌群结构的变化

2．2．3 “序列引导”方式的细菌分离

2．2．4 菌株Enterobacter cloacae B29的16S rRNA基因全长测序分析以及生化鉴定分析

2．2．5 菌株B29的全基因组测序分析

2．2．6 菌株B29的内毒素活性检测

2．2．7 菌株B29在无菌小鼠体内定植能力的分析

2．2．8 单一接种菌株B29对悉生小鼠出现肥胖和胰岛素抵抗症状的影响

2．2．9 菌株B29对悉生小鼠脂肪合成和存储相关基因的调节

2．2．10 菌株B29诱导的肥胖小鼠的内毒素载量同全身以及局部炎症反应水平的检测

2．2．11 菌株B29对悉生小鼠肠屏障功能的影响

2．2．12 菌株B29的悉生小鼠肠道中菌株B29的再分离与鉴定

2．3 讨论

2．4 本章小结与展望

参考文献

第三章 阴沟肠杆菌菌株B29在非酒精性脂肪性肝病发展过程中的作用研究

摘要

引言

3．1 材料与方法

3．1．1 动物实验

3．1．2 小鼠肝脏病理切片检查

3．1．2 小鼠胰岛素抵抗相关指标及其他血清生化分析

3．1．3 小鼠各个组织的炎性因子相关基因、脂代谢基因以及肠道通透性基因的实时定量表达分析

3．1．4 小鼠全基因组表达谱芯片检测

3．1．5 数据统计分析

3．2 实验结果

3．2．1 菌株B29的悉生小鼠肝脏病理切片的分析结果

3．2．2 菌株B29的悉生小鼠血清肝功指标的检测

3．2．3 菌株B29对悉生小鼠出现肥胖和胰岛素抵抗症状的影响

3．2．4 菌株B29对悉生小鼠血脂、脂肪合成以及存储相关基因的调节

3．2．5 菌株B29诱导的非酒精性脂肪性肝病小鼠的内毒素载量水平、全身以及局部炎症反应水平的检测

3．2．6 菌株B29对无菌小鼠基因表达的全基因表达谱分析

3．3 讨论

3．4 本章小结与展望

参考文献

论文创新点

附录1 Metagenomic sequencing DNA提取方法的建立

附录2 缩写及全名

附录3 通用溶液及培养基配方

附录4 仪器设备

致谢

已(待)发表的学术文章及参加的科研课题