太湖溶藻细菌及其溶藻活性物质的分离鉴定和蓝藻对溶藻细菌的化学防御作用

摘要

太湖是中国的第二大淡水湖，为太湖流域中近4000万人口提供了重要的经济和自然资源。太湖流域只占0.4％的国土面积，却贡献了近11%的国内生产总值。然而，在过去的二十年期间，因周围地区的工农业和生活污水污染，太湖逐渐向富营养化状态转变，随之而来的是太湖水体每年都会爆发以铜绿微囊藻和聚球藻为优势藻类的蓝藻水华。这些蓝藻水华造成了严重的经济和生态损失。在短期内，通过完全控制和削减进入湖泊的氮磷营养盐来预防蓝藻水华的爆发还存在很大的困难，如何应对应对每年爆发的蓝藻水华已成为一个急需解决的问题。在利用物理和化学等常规方法治理蓝藻水华不甚理想或存在诸多限制的情况下，用生物方法控制蓝藻水华就具有很大的潜在价值。溶藻细菌被广泛认为是有应用价值的除藻控藻生物。
　　本课题主要研究太湖水域的溶藻细菌，希望其可作为控制太湖蓝藻水华策略的组成部分。用于分离溶藻细菌的水样的采集时间为2009年10月和2010年9月，采集地点为爆发蓝藻水华的梅梁湾水域。本研究从这些经过富集处理后的水样中分离纯化得到191株细菌，随后通过将这些菌株的发酵液分别加入铜绿微囊藻9110藻液和聚球藻BN60藻液中来筛选具有溶藻效果的溶藻细菌，最终，筛选获得了12株对铜绿微囊藻具有很强溶藻效果的溶藻细菌，其分别命名为C10、E3、E10、F6、G9、H1、H5、J4、J5、K3、K4和L5，4株对聚球藻BN60具有很强溶藻效果的溶藻细菌，其分别为C11、F6、G2和H1（即菌株F6和H1对这两种蓝藻都具有很强的溶藻效果）。这些溶藻细菌的16S rDNA序列分析结果表明它们分别属于芽孢杆菌属（Bacillus，7株）、短波单胞菌属（Brevundimonas，2株）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas，2株）、丛毛单胞菌属（Comamonas，1株）、希瓦氏菌属（Shewanella，1株）和稳杆菌属（Empedobacter，1株）。在这些溶藻细菌中，短波单胞菌J4和寡养单胞菌F6被用于进一步研究。
　　在本研究中，经过不同方式处理后的溶藻细菌发酵液即发酵原液、除菌发酵液和无上清的菌细胞液（高纯水重悬）对铜绿微囊藻9110表现出显著差异的溶藻效果，表明溶藻细菌短波单胞菌J4和寡养单胞菌F6都是主要通过间接溶藻方式来实现溶藻的，即通过分泌胞外溶藻活性物质来实现溶藻。对于短波单胞菌J4，依次采用甲醇萃取短波单胞菌J4的除菌发酵液、硅胶柱层析和HPLC（高效液相色谱）技术等手段虽未成功分离纯化其分泌的溶藻活性物质，但结果表明J4至少分泌一种具有热稳定性和强极性等性质的溶藻活性物质；而对于寡养单胞菌F6，通过乙酸乙酯萃取F6的发酵液并以HPLC技术分离纯化得到两种溶藻活性物质F6-A和F6-B。紫外吸收光谱、气质联用和核磁共振等分析结果鉴定溶藻活性物质F6-A和F6-B分别为六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮（简称环（甘氨酸-脯氨酸））和对苯二酚。环（甘氨酸-脯氨酸）对铜绿微囊藻9110具有很强的溶藻效果，其EC50（半数有效浓度，24 h）为5.9 mg/L，而对聚球藻BN60没有任何的溶藻效果；对苯二酚对铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60都具有很强的溶藻效果，其EC50（24 h）分别为0.96和5.6 mg/L。本研究新发现了环（甘氨酸-脯氨酸）的溶藻能力，也初次报道了能够分泌环（甘氨酸-脯氨酸）和对苯二酚的溶藻细菌。
　　将短波单胞菌J4发酵液加入到蓝藻藻液中混合共培养，基于蓝藻生物量（以藻细胞或者叶绿色-a浓度表征）和溶藻细菌菌体浓度的动力学变化比较研究了短波单胞菌J4与两种蓝藻（铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60）的相互关系。结果显示：J4对铜绿微囊藻9110的溶藻效果（溶藻率为91.8%，6天）强于对聚球藻BN60的溶藻效果（溶藻率为48.6%，6天）。令人惊奇的是，在此过程中J4-BN60共培养液的J4浓度从第2天的1.7×109CFU/mL下降到第6天的6.9×105CFU/mL，而在J4-9110共培养液中未出现J4浓度下降的现象。分析表明J4-BN60共培养液的J4浓度的下降部分导致了J4对聚球藻BN60的溶藻效果差于对铜绿微囊藻9110的溶藻效果。随后的研究结果表明J4-BN60共培养液中J4菌体浓度的下降是由于在共培养过程中聚球藻BN60诱导性地分泌了能抑制J4的物质。这些结果暗示了聚球藻BN60对短波单胞菌J4的化学防御作用，即BN60通过诱导性地分泌抑菌类物质来降低J4菌体浓度进而削弱J4对其的溶藻效果。
　　将弃上清的F6菌细胞液（牛肉膏蛋白胨培养基稀释并重悬）分别与两种蓝藻（铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60）混合共培养，基于蓝藻生物量、F6菌体浓度和溶藻活性物质浓度的动力学变化比较研究了寡养单胞菌F6与两种蓝藻的相互关系，也探索溶藻细菌菌体浓度、溶藻活性物质浓度和溶藻效果之间的关系。结果显示：F6-9110共培养液和F6-BN60共培养液的蓝藻生物量从第0天至第1天是上升的，与对照组（加入等量的牛肉膏蛋白胨培养基替代溶藻细胞液）的蓝藻生物量无显著性差异；从第1天至第6天，两种共培养液的蓝藻生物量逐渐下降，而对照组的蓝藻生物量则逐渐上升，最终 F6对铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60的溶藻率分别为93.5%和79.7%（6天）。与此同时，F6-9110共培养液和F6-BN60共培养液的F6菌体浓度都从第0天的5×106CFU/mL增长到第2天的1.0-1.4×109CFU/mL，并且在第2天至第6天期间基本维持在1.0-1.4×109CFU/mL。应用LC-MS技术未在第0、1天的F6-9110和F6-BN60共培养液中检测到溶藻活性物质F6-A和F6-B，但F6-A和F6-B在F6-9110共培养液中从2天的0.30mg/L和0.63mg/L分别上升至第6天的4.42mg/L和5.28mg/L，在F6-BN60共培养液中从第2天的0.32mg/L和0.62mg/L分别上升至第6天的4.14mg/L和5.25mg/L。这些结果表明：寡养单胞菌F6对蓝藻的溶藻效果直接取决于溶藻活性物质的浓度,而溶藻活性物质的浓度取决于溶藻细菌的细胞浓度；寡养单胞菌 F6开始显著分泌溶藻活性物质的细胞密度阈值约为2-4×108CFU/mL。此外，寡养单胞菌F6不仅对铜绿微囊藻和聚球藻具有很强的溶藻效果，对其他的蓝藻和真核藻也具有一定的溶藻效果。
　　短波单胞菌J4对铜绿微囊藻9110具有很强的溶藻效果，而寡养单胞菌F6对铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60都具有很强的溶藻效果。分离纯化获得的溶藻活性物质环（甘氨酸-脯氨酸）和对苯二酚也具有很强的溶藻能力。这些研究结果表明它们是很有应用价值的除藻控藻生物，具有应用于控制太湖蓝藻水华的潜力。本研究新发现了蓝藻（聚球藻BN60）在溶藻细菌（短波单胞菌J4）的溶藻作用下会诱导性地分泌抑菌类物质进而抑制此溶藻细菌的现象，其反映了蓝藻对溶藻细菌的化学防御作用，也表明太湖中蓝藻与溶藻细菌的相互关系是复杂而多变的，不只有溶藻细菌对蓝藻单方面的溶藻作用，也存在蓝藻对溶藻细菌的抑制作用。然而，本研究只有在聚球藻BN60和短波单胞菌J4之间发现了化学防御作用，表明蓝藻对溶藻细菌的化学防御只发生于特定的溶藻细菌和蓝藻之间。因此，在实际应用溶藻细菌时，蓝藻对溶藻细菌的防御作用值得重视。

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第一章 绪论

1.1 自然水体富营养化与藻类水华

1.2 控制藻类水华的策略与技术

1.3 溶藻细菌与溶藻活性物质的研究进展

1.4 本研究课题涉及的技术

1.5 本课题的研究意义和研究目的

参考文献

第二章 溶藻细菌的分离与鉴定

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

本章小结

参考文献

第三章 短波单胞菌J4的溶藻活性物质分离纯化和聚球藻BN60对J4的化学防御作用

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5本章小结

参考文献

第四章 寡养单胞菌F6及其溶藻活性物质的研究

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

本章小结

参考文献

第五章 全文总结

5.1 主要结论

5.2 展望

论文的创新性

附录1 缩写词列表

致谢

攻读博士学位期间发表论文和申请专利

声明

答辩决议书