两个ABCG转运蛋白OsABCG26和OsABCG15协同调控水稻花药及花粉发育

摘要

水稻是重要的单子叶模式研究植物，也是最重要的粮食作物之一，作为水稻雄性生殖细胞的花粉的发育与水稻的产量紧密相关，同时水稻杂交育种也离不开对雄性不育系的利用。因而深入了解雄性生殖细胞花粉的发育机理，对提高水稻产量极为重要。我们通过60Coγ射线对粳稻品种9522进行辐射诱变获得突变体库，并通过遗传筛选得到一个单基因控制的雄性不育突变体，通过图位克隆分离到控制该雄性不育表型的基因 OsABCG26，同时，我们对 OsABCG26功能缺失突变体 osabcg26进行了详细的表型分析并深入研究了其生物学功能。主要研究结果如下：
　　植物表皮角质层对植物抵御环境压力起到关键作用，植物营养器官角质层的发育机制已经被深入的研究，然而雄性生殖器官花药角质层的发育机制仍不清楚。为研究水稻花药角质层发育机制,我们分离到一个花药角质层缺陷的雄性不育突变体osabcg26。成熟期的osabcg26突变体花药呈白色，并且小于野生型花药。半薄切片分析发现，由于osabcg26突变体绒毡层不正常降解和花粉粒没有内含物的形成导致花药腔最终塌陷，甲苯胺蓝染色很深的物质充满花药腔。SEM和TEM电镜观察发现，osabcg26突变体花药表面光滑，角质层不能正常形成，花粉外壁外层和外壁内层之间部分在发育后期消失。生化测定发现，osabcg26突变体花药表面角质层角质和蜡质的沉积量都低于野生型，特别是角质沉积量发生剧烈的下降。利用图位克隆和互补实验分析，我们发现10号染色体短壁上OsABCG26基因在655th位置处发生一个碱基的置换导致osabcg26突变体雄性不育，OsABCG26编码一个ABCG亚家族转运蛋白。
　　为了确定 OsABCG26的具体功能，我们对 OsABCG26基因的表达模式和OsABCG26蛋白定位进行了详细分析。利用定量RT-PCR分析发现，该基因在花药中高度表达，且在花药发育的第十期，表达量最高，在根、茎、叶和其他非生殖花器官有低量的表达，然而在雌蕊中也有高度表达。启动子活性分析显示OsABCG26在花药表皮层、内层和绒毡层都高度表达。为了确定OsABCG26蛋白亚细胞定位，我们构建了PSAT6-eYFP-OsABCG26表达载体，并瞬时转化到洋葱表皮细胞中，发现 OsABCG26蛋白定位在细胞质膜上。同时，我们把双元载体pCAMBIA1301-pOsABCG26-eYFP-OsABCG26导入到突变体osabcg26中，结果显示eYFP-OsABCG26融合蛋白能够互补osabcg26突变体的不育表型，表明eYFP-OsABCG26是有功能的融合蛋白。利用激光共聚焦荧光显微镜观察发现，在花药发育的第九期，eYFP-OsABCG26定位在花药壁表皮层、内层和绒毡层的质膜上，此时，中层降解的几乎不可见。同时，定量分析发现绒毡层表达的涉及花药角质层脂类代谢的基因CYP704B2、CYP703A3和DPW在osabcg26突变体中表达量都发生显著性下降。以上结果表明，OsABCG26主要涉及花药角质层前体从绒毡层到花药表面的转运。
　　我们以前鉴定到另一个ABCG转运蛋白基因OsABCG15，osabcg15突变体花药角质层和花粉外壁都不能正常形成，并发现 OsABCG15在花药绒毡层高度表达。然而 OsABCG15蛋白定位一直不清楚。本研究中，我们通过eYFP-OsABCG15融合蛋白瞬转烟草发现ABCG15定位在细胞质膜上，同时将双元载体pCAMBIA1301-pOsABCG15-eYFP-OsABCG15导入到突变体osabcg15中，结果能互补osabcg15的不育表型，说明eYFP-OsABCG15等同于OsABCG15的功能。荧光观察发现 OsABCG15特异性定位在绒毡层细胞膜上，并呈现面向花药腔一侧的极性定位。并且 osabcg15突变体没有花粉壁的形成，以上结果表明OsABCG15主要涉及孢粉素前体的转运。
　　以前我们报道，OsABCG15功能突变导致花药在减分后呈现发育缺陷，包括绒毡层不正常降解、花粉外壁和花药角质层结构缺陷等。为了解 OsABCG15和OsABCG26的功能关系，我们构建了osabcg26 osabcg15双突变体。组织切片发现osabcg26 osabcg15双突变体花药外壁光滑、花粉外壁不能正常形成并且最后降解。生化分析也发现 osabcg26 osabcg15双突变体蜡质含量比 osabcg26或osabcg15单突变体更低。osabcg26 osabcg15双突变体角质含量与 osabcg26或osabcg15单突变体相比没有明显的变化。总体上，osabcg26 osabcg15双突变体表型类似于osabcg15单突变体表型。
　　综上所述，我们认为在水稻花药发育过程中，OsABCG26主要参与花药角质层前体从绒毡层到花药表面的转运过程，OsABCG15主要涉及孢粉素前体从绒毡层到花药腔的转运过程，这对于解释花药角质层和花粉外壁发育机制起到重要作用。同时我们的研究也表明花药角质层前体和花粉外壁前体在绒毡层具有共同的代谢途径，拓展了人们对绒毡层功能的认识。

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第一章 综述

1.1 引言

1.2 植物表皮角质层发育

1.3 花粉外壁发育

1.4 花药绒毡层发育

1.5 ABCG转运蛋白的研究进展

1.6 本文主要研究目的和意义

第二章 材料和方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

第三章 两个ABCG转运蛋白OsABCG26和OsABCG15协同调控水稻花药及花粉发育

3.1 引言

3.2 结果与分析

3.3讨论

3.4 本章小结

第四章 总结和展望

4.1研究结论

4.2 研究创新性

4.3研究展望

参考文献

附录

致谢

攻读博士学位期间已(将)发表论文