蜕皮激素诱导人IGF-Ⅰ在中枢神经系统特异性表达的转基因小鼠模型的建立

摘要

为了能够方便、准确而且真实地研究IGF-Ⅰ在中枢神经系统的发生发育过程中以及在各种应激、胁迫或疾病条件下所发挥的神经生物学作用及其作用机制,特别需要建立一个能够在不同的时相下在中枢神经系统特异性即时性表达人IGF-Ⅰ的转基因小鼠模型,为此开展了下面的研究.首先,需要得到一个能够指导外源蛋白在中枢神经系统中特异性表达的启动子.神经胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)为神经胶质细胞的主要骨架蛋白,该蛋白的表达主要局限于中枢神经系统的星形胶质细胞中,传统上被认为是神经胶质细胞的特异性标志物.由于当时GFAP基因的调控序列尚属未知,因此需要克隆小鼠GFAP基因的5'端调控区.该研究采用PCR方法筛选129sv小鼠的基因组文库,经过两轮的PCR筛选和一次噬菌斑原位杂交,成功地从文库中分离到载有GFAP基因的阳性噬菌体,最终获得了包括GFAP基因1.8Kb的5'端调控区和部分编码区在内2353bp的核苷酸序列,该段序列已经被GeneBank收录(收录号:AY279974).经与GeneBank中已有的GFAP基因序列进行比对,发现不同种属小鼠的GFAP基因存在不同的翻译起始位点和N端氨基酸序列.我们利用得到的GFAP基因1.8Kb的5'端调控区构建了中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因载体pGFAP-Cre-hGH.通过显微注射的方法获得了7只基因组中整合有pGFAP-Cre-hGH的转基因小鼠(命名为:GFAP-Cre).PCR和Southern检测都证实7只GFAP-Cre鼠的基因组中的确整合有转入基因.将GFAP-Cre鼠与ROSA26小鼠进行交配,检测GFAP-Cre鼠中Cre重组酶的表达情况.分别选取同时携带有两种基因发育至13d的小鼠胚胎和两周龄小鼠的各种组织制作切片进行LacZ染色.结果证明只有GFAP-Cre鼠的脑部广泛表达有活性的Cre重组酶,在间脑的脉络丛区表达尤为集中,具有理想的组织特异性.我们还构建了包含由LoxP序列锚定的neomycin基因组成的阻断序列、蜕皮激素诱导表达系统和截短型人IGF-Ⅰ的表达框在内的受控型蜕皮激素诱导表达人IGF-Ⅰ的转基因载体pCE-IGF-Ⅰ.将pCE-IGF-Ⅰ转染AM1菌感受态,利用其中表达的Cre重组酶将LoxP序列锚定的neomycin基因删除,解除对前面启动子的阻断作用.将GFAP-Cre鼠与CE-IGF-Ⅰ鼠进行交配,选取携带有两种基因的子代鼠,此类鼠即为我们最后的目的鼠—蜕皮激素诱导截短型人IGF-Ⅰ在中枢神经系统特异性表达的转基因小鼠模型.利用PCR方法检测证实脑部特异性表达的Cre重组酶介导了其间LoxP位点间neomycin的删除.利用RT-PCR方法检测证实删除阻断序列后蜕皮激素诱导表达系统的两个转录激活因子VgEcR和RXR进行了转录,并且在Muristerone A诱导后成功地激活了后面表达框内人IGF-Ⅰ的转录.选取经Muristerone A诱导后的转基因鼠脑组织制做切片进行免疫组化染色.染色结果证明:经Muristerone A诱导后的转基因鼠的脑部成功表达了人IGF-Ⅰ,与Cre重组酶的表达模式相似主要集中在间脑的脉络丛区表达.

目录

摘要

ABSTRACT

前言

第一章 129sv小鼠神经胶质细胞原纤维酸性蛋白调控序列的克隆与分析

材料

方法

结果

讨论

参考文献

第二章 中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的建立

材料

方法

结果

讨论

参考文献

第三章 受控型蜕皮激素诱导表达人IGF-Ⅰ的转基因小鼠的建立

材料

方法

结果

讨论

参考文献

第四章 蜕皮激素诱导人IGF-Ⅰ在中枢神经系统特异性表达的转基因小鼠模型的建立与鉴定

材料

方法

结果

讨论

参考文献

总结

硕博期间发表文章

致谢

附录发表文章

中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠

利用转基因动物模型研究胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)在中枢神经系统中的生物学作用

利用体内噬菌体展示技术进行人源肿瘤细胞特异性结合肽的筛选