依赖于氧化脱甲氧基的黄脂菌素xanthone环的生物合成研究

摘要

黄脂菌素具有高度氧化且呈角状折叠排列的六环骨架和核心的xanthone环，属于聚环xanthone类化合物。黄脂菌素具有良好的抗细菌、抗真菌及抗肿瘤活性，其药效基团xanthone环的生物合成机制是聚环xanthone类抗生素生物合成研究中的关键科学问题。前期已经克隆了黄脂菌素的生物合成基因簇，并初步预测了黄脂菌素的生物合成途径。然而，黄脂菌素核心结构xanthone环的形成以及多种后修饰的酶学机制尚未解析。本论文针对核心xanthone环形成和甲基化、氯代、氧化等后修饰过程展开研究，以期完善对黄脂菌素生物合成途径的认识，并为获得更高活性的黄脂菌素衍生物提供理论依据。
　　首先，研究了核心结构xanthone环的生物合成机制。本研究中以?xanO4突变株积累的蒽醌化合物5为底物，成功实现了由Baeyer-Villiger单加氧酶XanO4催化的xanthone环的体外重建。利用同位素标记的氧气，揭示了XanO4催化xanthone环的形成涉及到连续两个氧原子的插入，发生氧原子对底物蒽醌分子中羰基基团和甲氧基基团的氧化替换，伴随着一个新颖的脱甲氧基反应。另外，对Xa nO4同源蛋白Arx30的生化活性分析，证实了XanO4催化xanthone环形成反应在同类化合物生物合成过程中的普遍性。
　　基于序列比对分析，构建了XanO4和Arx30蛋白中第45位精氨酸（R45）的定点突变体XanO4R45A和ARX30R45A，体外酶学活性实验证实了R45对于xanthone环形成的必要性；突变体蛋白对化合物5的酶学转化获得了C17位脱甲基的蒽醌类似物（化合物5f）；XanO4和Arx30对5f的酶学活性分析证明了化合物5中C17位甲氧基对xanthone环形成的必要性。
　　C17位羟基上的甲基是黄脂菌素分子结构中形成亚甲基双氧桥结构域所必需的，然而XanO4催化化合物5中C17位脱甲氧基反应的同时向反应产物化合物12中引入了一个新的羟基基团。这就暗示着在黄脂菌素生物合成过程中存在一步隐藏的C17位羟基的再次甲基化。本研究利用遗传学和生物化学的方法初步确定了黄脂菌素生物合成基因簇中三个氧甲基转移酶的功能：Xa nM1负责黄脂菌素生物合成早期化合物5的前体分子中C17位羟基的甲基化；XanM2负责xanthone环形成之后﹑亚甲基双氧桥形成之前，C13位羟基的甲基化；XanM3负责隐藏在xanthone环形成之后﹑氨基化之前，C17位羟基的再次甲基化。
　　最后，通过对黄脂菌素生物合成基因簇中唯一的氯代酶基因x anH的研究，证实了xanthone环结构单元和C17位甲氧基对氯代反应的必要性。
　　总之，本论文系统研究了XanO4催化xanthone核心环形成的酶反应，揭示了伴随脱甲氧基化而实现环酮到环醚转化的酶反应机制，拓展了对天然产物生物合成中Baeyer-Villiger氧化反应类型的认识，为发展高效、绿色的xanthone结构元件生物合成方法提供了范例。同时，对氧甲基转移酶和氯代酶的研究，揭示了黄脂菌素生物合成过程中隐藏的一步转甲基反应，证明了xanthone环和氧甲基基团对其它后修饰反应的重要性。本研究为后续深入阐明聚环xanthone类抗生素的生物合成途径，以及通过合成生物学的方法改造黄脂菌素的结构奠定了基础。

目录

声明

符号说明

第一章 文献综述

1.1 Xanthone 类化合物简介

1.2微生物来源的聚环Xanthone类化合物简介

1.3 Baeyer-Villiger氧化反应

1.4 Baeyer-Villiger单加氧酶

1.5本课题的研究意义

第二章 实验材料与方法

2.1实验材料

2.2 实验方法

第三章 黄脂菌素xanthone核心环生物合成机制的研究

3.1 前言

3.2 结果与分析

3.3 本章小结

第四章 氯代酶XanH功能的研究

4.1 前言

4.2 结果与分析

4.3小结与讨论

第五章 黄脂菌素生物合成过程中氧甲基转移酶功能的研究

5.1前言

5.2 结果与分析

5.3小结与讨论

第六章 总结与展望

6.1 本研究工作总结

6.2 本研究主要创新点

6.3 本研究工作展望

参考文献

附录

附录一 化合物12的核磁共振图谱

附录二 化合物13的核磁共振图谱

附录三 化合物14的核磁共振图谱

附录四 化合物6f的核磁共振图谱

攻读学位期间发表或已录用的学术论文

致谢