基于微阵列的多重核酸检测新技术的开发及其在转基因作物检测中的应用研究

摘要

随着转基因作物在全球的迅速发展，越来越多的转基因作物被批准进入市场，其外源插入片段的组成也愈加复杂化和多样化，同时，市场上未批准转基因作物的非法流通、作物及产品中转基因成分的低水平混杂时有发生，这对当前转基因作物及产品的检测提出了很高的要求，亟需能同时检测大量靶标、快速高效、操作简单、经济的检测方法。然而目前转基因成分的多重检测方法面临诸多问题和挑战，如可并行检测的靶标数目较少、扩增与检测分开使得检测步骤多耗时长、缺乏便携式检测平台等。另一方面，多重核酸检测在其它诸多领域如疾病诊断、微生物检测、食品安全以及环境监测等方面也有着迫切的需求，而转基因多重检测面临的问题其实也是当前整个多重核酸检测领域面临的共性问题。针对上述问题，在本论文的研究中，我们以引物及反应的物理隔离为指导思想，在多个平台上成功构建了一整套基于微阵列的多重核酸扩增及检测新技术，将这些方法成功应用于转基因作物的高通量检测中，一定程度上解决了当前转基因作物检测面临的主要问题,同时也为当前整个多重核酸检测领域提供了一种新的解决方案。
　　首先，为了提高转基因多重检测中可并行检测的靶标数目，本论文以本实验室发明的一套基于亲疏水微孔阵列芯片的多重PCR方法为基础，设计开发了一套用于转基因靶标多重并行扩增的芯片多重PCR平台和一张用于识别多种转基因靶标分子的DNA芯片，将二者相结合，建立了一套目前世界上最高通量的转基因检测平台MACRO(Multiplex Amplification on a Chip with Readout on an Oligo microarray)，能够在一次反应中同时检测91种转基因相关靶标，检测范围覆盖到超过97%的现有商业化转基因作物品系。同时，用多种模拟样本和实际样本进行测试的结果表明本方法的特异性接近100%，灵敏度满足转基因日常检测的实际要求，实验室自配复杂样本和海关抽检盲样的检测结果分别与理论预期和当前转基因检测的金标准real-time PCR方法检测的结果100%一致。本方法是世界上第一个可全局性监测转基因作物及产品的多重检测方法，对日常转基因作物及产品的检测和监管有着重要的实际意义。
　　接着，针对当前方法中扩增及检测分开增加了操作步骤和检测时间的问题，本论文进一步对MACRO技术平台进行了改进，建立了集扩增与检测于一体的FLAC（Fluorescent-Labeled Amplification and analysis on Chip）多重检测平台。我们采用TaqMan probe技术，对芯片PCR产物进行荧光标记，同时在芯片PCR后用盖片的简单方式对芯片进行封闭，使得芯片PCR后可以直接通过芯片扫描仪读取荧光信号，实现了芯片PCR产物的在片检测，使原本的检测时间缩短了一半以上。我们将此方法用于转基因检测中，选择了一些重要的的高频转基因元件以及转基因作物的植物内源参照基因进行测试，成功实现了对19种转基因相关靶标的一次性并行快速检测，结果初步表明本方法具有很高的特异性和灵敏度。
　　最后，为了提高多重核酸检测的便携性，本论文利用和前述方法中同样的引物及反应物理隔离的思路，设计制作了一种集成毛细管阵列的多重微反应器，并在此基础上结合可视化LAMP技术，开发了一套简单快速且经济的便携式多重核酸可视化检测平台CALM（Capillary Array-based LAMP for Multiplex visual detection of nucleic acids）。在该方法中，我们通过特殊的毛细管微阵列设计和亲疏水处理，同时对加样装置进行了巧妙的设计，可以用移液器一次性将反应液非常方便地加入所有毛细管中并同步进行扩增及检测。本方法能在半小时到一小时之内完成反应及检测，且结果可直接肉眼检测，无需配套检测设备。本平台简单便携、对仪器和电力依赖低，未来有望用于现场实时检测（point of care test，POCT）等领域。在本论文中，我们同样将此方法应用于转基因检测，成功实现了对8种常见转基因相关靶标的快速可视化多重检测。模拟样本和实际样本测试的结果表明本方法具有很高的特异性、灵敏度、准确度和实用性。
　　综上所述，本论文针对转基因作物检测和整个多重核酸检测领域面临的问题和挑战，以多种形式的微阵列为载体、以引物及反应的物理隔离为指导思想，建立了一整套简便通用的多重核酸检测方法，这些方法可大大提高多重核酸检测的重数，同时又兼具高特异性和灵敏度、方法简便、灵活、通用等优点。所有这些方法均被成功地应用于对多重核酸检测有着迫切需求的转基因作物检测中，显示了良好的效果和相比其它传统检测方法的优势，因此，这些方法在转基因检测领域有着现实的应用价值，同时也为当前多重核酸检测领域提供了一整套较好的解决方案。

目录

声明

缩略词表

第一章 绪论

1.1 转基因作物及其检测方法

1.2 多重核酸检测

1.3 本论文研究的目的、内容和意义

第二章 MACRO转基因高通量检测平台的构建

2.1实验材料、试剂和仪器

2.2 实验方法

2.3 实验结果和分析

2.4 本章讨论与小结

第三章 FLAC扩增检测一体式多重核酸检测方法的构建及在转基因检测中的应用

3.1 实验材料、试剂与仪器

3.2 实验方法

3.3 实验结果和分析

3.4 本章讨论与小结

第四章 CALM便携式多重核酸可视化检测平台的构建及在转基因检测中的应用

4.1 实验材料、试剂与仪器

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结和讨论

第五章 总结与展望

5.1 研究内容总结

5.2 本研究的创新点

5.3 展望

参考文献

附录

附表1 105对验证成功的特异性引物

附表2 105对用于构建质粒的引物

附表3 最终91个转基因靶标的引物探针信息

附表4 转基因靶标事件所含元件信息

附表5 上海出入境检验检疫局样本Real-time PCR验证的引物和探针信息

附表6 10个SHCIQ样品的Real-time PCR实验Ct值信息

附表7 用于芯片荧光PCR在片检测的引物和TaqMan探针序列信息

附表8 用于CALM平台的LAMP引物序列信息

附表9 CALM实验中SHCIQ样本Real-time PCR验证的引物和探针信息

附表10 CALM平台验证中5个SHCIQ样品的Real-time PCR实验Ct值信息

致谢

攻读博士学位期间主要研究成果及所获奖励