鱼类细菌性烂鳃病病原研究及其营养相关基因和毒力基因缺失载体的构建

摘要

细菌性烂鳃病是危害淡水养殖动物的主要细菌性疾病之一,症状为烂鳃、鳍条或皮肤溃烂,可危害多种鱼类并造成大量死亡,对水产养殖业造成巨大的经济损失。因此,有必要研制一种应用方便、绿色、安全的疫苗来防治鱼类细菌性烂鳃病,而国内尚无烂鳃病减毒活疫苗方面的研究。本研究对分离的烂鳃病病原进行了分类鉴定,克隆了asd、aroA和clsA基因并分别构建了基因缺失自杀性质粒载体,从而为构建营养缺陷型或主要毒力因子缺失型突变株提供了平台,为探索开发具有产业化前景的浸泡型鱼类细菌性烂鳃病基因减毒活疫苗奠定了良好的基础。主要工作如下:
　　 本研究从发病的斑点叉尾鲴、斑鳠、鳗鲡和草鱼上分离到病原,经回归感染试验证明是烂鳃病的病原菌。四株菌电镜结果表明,菌株GHS061212和Mg2形态一致,无荚膜结构,而菌株M168和M165有明显的荚膜结构。常规生理生化试验结果显示四株菌均为黄杆菌属；为进一步确定到种,对各菌株的16S rRNA基因部分序列进行了测定和分析,结果表明菌株M165和M168与约氏黄杆菌Flavobacterium johnsoniae strain H2P6(EU221404)的同源性最高,为99.9％；菌株GHS061212和Mg2与柱状黄杆菌.Flavobacterium columnare(AY841899)的同源性最高,分别为98.2％和99.8％,以16S rRNA基因构建的系统进化树表明,菌株M165和M168与约氏黄杆菌聚类,菌株GHS061212和Mg2与柱状黄杆菌聚类。根据以上结果将菌株M165和M168鉴定为约氏黄杆菌,菌株GHS061212和Mg2为柱状黄杆菌,研究结果表明鱼类细菌性烂鳃病的病原有柱状黄杆菌和约氏黄杆菌两种,并在国内首次报道了约氏黄杆菌为鱼类烂鳃病的病原。
　　 营养缺陷型菌株的构建主要是通过缺失细菌代谢所必须的酶的基因,致使细菌在环境中及宿主体内不能增殖而使其毒力减弱。asd基因所编码的天冬氨酸半醛脱氢酶是二氨基庚二酸(DAP)合成途径中的关键酶,aroA基因编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合成酶)是芳香族氨基酸合成中的关键酶。本研究分别克隆了asd和aroA基因,并分别构建其自杀性质粒载体。根据asd(Aspaltate-semialdehyde dehydrogenase)基因和aroA(aromatic amino acid biosynthesis)基因的保守序列设计引物,以菌株M165基因组DNA为模板,扩增得到两基因的核心序列,再利用基因组步移方法扩增得到asd和aroA基因的全长及两翼序列。其中所测的asd基因及其两翼序列全长2097bp,asd基因开放阅读框(ORF)位于531bp～1521bp,长990bp,5’非编码区为为530bp,3’非编码区为.576bp。成功构建自杀性质粒载体pRE112△asd,该质粒缺失asd基因ORF内部783bp的核苷酸序列,且缺失了asd基因的催化活性位点Cys127和His235。所测的aroA基因及其两翼序列全长1579bp,aroA基因开放阅读框(ORF)位于306bp～1536bp,长1230bp,编码410aa,该基因5’非编码区为306bp,3’非编码区为43bp。成功获得反向选择标记自杀性质粒载体pRE112△amA,其缺失aroA基因内部773bp的核苷酸序列,使aroA基因移码突变。为构建约氏黄杆菌asd和aroA基因缺失突变株提供了基础。
　　 硫酸软骨素AC裂解酶能够降解酸性多糖,被认为是柱状黄杆菌的毒力因子。clsA基因编码硫酸软骨素AC裂解酶,因此,本研究根据GenBank中登陆的clsA基因序列扩增得到clsA基因的全序列,并通过引物改造获得clsA基因的长度为663bp的N端上游同源臂和567bp的C端下游同源臂,经过重叠PCR得到长为1230bp的同源臂突变盒,再与自杀性质粒pRE112定向连接,成功得到重组自杀性质粒载体pRE112△clsA,缺失片段长为1082bp,其中包含了clsA的四个催化位点,为野生型的柱状黄杆菌毒力基因突变株的构建打下了基础。
　　 本研究在国内首次研究报道约氏黄杆菌为鱼类烂鳃病的病原,分别克隆了约氏黄杆菌asd和aroA基因,并构建了约氏黄杆菌营养因子缺失自杀性质粒载体和柱状黄杆菌毒力因子缺失自杀性质粒载体。在此基础上,可进一步构建营养因子缺失的约氏黄杆菌突变株和毒力基因缺失柱状黄杆菌突变株,为细菌性烂鳃病基因缺失活疫苗研制奠定基础。