产过氧化氢酶菌株的筛选、鉴定与高产菌株CE-2-A的诱变选育和发酵条件优化

摘要

过氧化氢酶广泛存在于动物、植物和微生物中，具有非常重要的生理功能，其中最主要的是参与活性氧代谢过程。过氧化氢酶在清除超氧自由基、阻止或减少羟基自由基形成等方面发挥重要作用。另外，过氧化氢酶广泛应用于食品消毒、临床分析、医学诊断以及纺织、造纸、制浆等工业。本论文对过氧化氢酶产生菌进行了筛选、鉴定、诱变选育和产酶发酵条件研究。
　　 依据过氧化氢酶的底物，建立了产过氧化氢酶菌株的简便而有效的筛选模型。在初筛的平板培养基添加一定量的H2O2，使用摇瓶发酵测酶活的方法进行复筛。对产过氧化氢酶微生物进行大量的筛选，从中筛选出一株产过氧化氢酶菌株CE-1，其所产过氧化氢酶活性为1356.2U/ml。
　　 菌株CE-1为革兰氏阴性杆状细菌，菌体大小为0.2-0.5×1.0-4.4μm，根据其形态特征、16SrRNA基因序列系统进化树分析和生理生化特性以及属内不同种问性状差异等因素的综合分析，将菌株CE-1鉴定为气单胞属(Aeromonas)细菌。
　　 为了使菌株CE-1适应发酵坐产的需求，对其进行了原生质体紫外线诱变。首先确定了菌株CE-1的原生质体制备与再生的最佳条件：培养基中添加10mg/mL的甘氨酸，培养8h后制备原生质体，首先用0.05mol/L的EDTA处理菌体60min，再用2 mg/mL的溶菌酶酶液在30℃条件下，酶解60min后，以0.6mol/L蔗糖作为稳定剂，原生质体形成率可达92.3％，再生率达到25.1％。紫外线诱变原生质体后，对再生突变株大量筛选，最终获得高产稳定的产过氧化氢酶菌株CE-2-A，其产酶活力达到1849.7U/ml，比出发菌株提高36.4％，诱变效果较为明显。
　　 为了提高菌株CE-2-A的产酶水平，对其发酵条件进行优化。首先运用了单因子实验筛选出了发酵培养基的麦芽糖含量、牛肉膏含量、CaCl2和MgCl2含量。然后采用Plackett-Burman设计进行多因素快速筛选试验并对影响菌株CE-2-A产过氧化氢酶活力的8个因素进行评价，筛选出了三个显著因素：装液量、牛肉膏含量和培养基起始pH。用响应面法(RSM)在三个水平上，即装液量(30mL、35 mL、40mL)、牛肉膏含量(3.00 g/L、3.50 g/L、4.00 g/L)和培养基起始pH(8.0、9.0、10.0)，对显著性因素进一步优化，考察其交互作用。通过求解发酵模型的回归方程，确定了菌株CE一2-A的最佳培养基和培养条件。菌株CE-2-A的最佳培养基为：麦芽糖含量4.0 g/L、装液量42.6 mL、牛肉膏含量3.69 g/L、氯化钙含量和氯化镁含量均为0.001 mol/L、起始pH为9.1；最佳培养条件为：20℃，按装液量的1.5％进行接种培养。过氧化氢酶活力由1849.7 U/mL提高到2532.49 U/mL，与模型预测值(2540.86 U/mL)一致。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1过氧化氢酶的研究概况

1.1.1过氧化氢酶的类型划分

1.1.2产过氧化氢酶的微生物

1.1.3过氧化氢酶的空间结构

1.1.4过氧化氢酶活力的测定方法

1.2原生质体紫外诱变育种的研究进展

1.3响应面法优化微生物发酵条件的研究进展

1.3.1 Plackett-Burman设计法

1.3.2响应面法(RSM)

第二章产过氧化氢酶菌株CE-1的筛选与鉴定

2.1材料和方法

2.1.1实验材料

2.1.2主要试剂和仪器

2.1.3水样

2.1.4产过氧化氢酶菌株的筛选和分离

2.1.5酶活力的测定

2.1.6菌体形态特征的观察

2.1.7菌株16S rDNA的PCR扩增和测序以及系统发育树分析

2.1.8产过氧化氢酶菌株的生理生化鉴定

2.2结果与分析

2.2.1菌株筛选

2.2.2菌株鉴定结果

2.3结论

第三章菌株CE-1原生质体的紫外诱变

3.1材料与方法

3.1.1菌种、培养基及试剂

3.1.2菌体生长曲线的绘制

3.1.3原生质体制备与再生

3.1.4紫外线诱变原生质体的方法

3.1.5目的突变菌株的筛选

3.2结果与分析

3.2.1生长曲线绘制

3.2.2原生质体制备与再生的影响因素

3.2.3紫外线诱变原生质体

3.2.4目的菌株的筛选结果及传代次数对产酶的影响

3.2.5菌株CE-2-A全菌体蛋白电泳

3.3结论

第四章过氧化氢酶高产菌株CE-2-A发酵条件的优化

4.1材料与方法

4.1.1菌种及培养基

4.1.2主要试剂及设备

4.1.3发酵培养

4.1.4过氧化氢酶酶活力的测定

4.1.5产酶培养基的优化

4.2结果和分析

4.3结论

全文结论

参考文献

致谢