杜仲叶中绿原酸、黄酮的提取、分离纯化及结构鉴定

摘要

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是具有保健功效的药用植物，近年来研究发现，杜仲叶主要成分与杜仲皮相近，且具有等同药理功效，为了进一步分析杜仲叶中具体的功效因子。本文以杜仲叶为研究对象，通过对杜仲叶有效成分不同方法的提取、分离、纯化研究;通过薄层色谱和紫外光谱分析，并经电喷雾源-质谱和核磁共振检测对纯化组分进行结构分析，旨在进一步确定最佳提取分离方法，发现杜仲叶有效成分的分子结构，为杜仲叶的开发利用奠定基础。主要研究结果如下: 1.杜仲叶有效成分的提取 分别采用回流法、超声波法、微波法对杜仲叶中有效成分进行提取。考察料液比、提取时间、乙醇浓度、溶剂pH值、提取次数等因素对有效成分提取率的影响，经正交试验优化，最终比较得出采用超声波辅助回流提取法较好。最佳提取工艺为:料液比为1∶10，提物温度80℃，乙醇浓度30％,提取溶剂pH值为5，先超声波提取30min，然后回流法提取30min，重复此操作1次。 根据最优工艺组合，称取5kg杜仲叶进行扩大试验，最终杜仲叶提取物的出粉率为24％，其中含绿原酸22.29％，含总黄酮54.67％。 2.杜仲叶粗提物的分离纯化 首先从九种大孔树脂中筛选出最佳的吸附树脂为NKA-Ⅱ，对绿原酸的静态吸附量为17.17mg/g，吸附率为90.92％，解吸率为75.63％，对总黄酮的静态吸附量为49.16mg/g，吸附率为90.44％，解吸率为70.02％;然后通过静态吸附-解吸试验表明，NKA-Ⅱ树脂属于快速平衡型树脂，静态吸附4h后达到吸附饱和，最佳的吸附液pH值为4，用70％乙醇为解吸液可将绿原酸、黄酮类化合物有效的洗脱下来;接着通过动态吸附-洗脱试验结果显示，上样液浓度为绿原酸0.9012mg/mL，总黄酮3.4406mg/mL;上样液流速为1.0mL/min，上样液体积不宜超过10倍的柱体积。 根据小试验的优化参数，进行扩大试验。称取600g杜仲叶粗提物，经NKA-Ⅱ大孔树脂分离，依次采用纯净水(18L)、30％乙醇(9L)、50％乙醇(15L)、70％乙醇(12L)、90％乙醇(3L)进行梯度洗脱，得到三个组分依次为FA(64.93g)、FB(36.06g)和FC(30.27g)。其中FA含有大量的绿原酸类物质，FB中既含有绿原酸类物质又含有黄酮类物质，FC主要含黄酮类化合物，故选用FA和FC进行纯化。 称取25g的组分FA，采用乙醇-水(0％、10％、20％、30％、40％)梯度洗脱，经聚酰胺柱分离得到三个组分FA-1、FA-2和FA-3，收集第21～70管洗脱液浓缩后，再经Sephadex LH-20树脂纯化得到组分FA-2。 称取25g的组分FC，采用乙醇-水(0％、30％、40％、50％、60％、70％、90％)梯度洗脱，经聚酰胺柱分离得到五个组分FC-1、FC-2、FC-3、FC-4和FC-5，将第27～73管、第105～150管、第295～315管洗脱液浓缩冷冻干燥后，再分别经Sephadex LH-20树脂纯化得到组分FC-2、FC-3、FC-4。 3.纯化组分的结构鉴定 薄层色谱分析表明，在此展开体系下四个组分的斑点清晰而集中，组分FA-2的Rf值为0.265与绿原酸标准品一致，组分FC-2、FC-3、FC-4的Rf值分别为0.632、0.211、0.737，属于黄酮类化合物。 紫外光谱分析结果显示，组分FA-2的最大吸收波长为324nm，其紫外吸收特征与绿原酸标准品一致;组分FC-2、FC-3、FC-4具有黄酮类化合物典型的紫外吸收特征峰，其带ⅠUVmax分别为349nm、345nm、367nm，带ⅡUVmax分别为256nm、254nm、254nm，推断组分FC-2和FC-3为黄酮苷类化合物，组分FC-4可能为槲皮素。 经电喷雾源-质谱检测和核磁共振检测综合推断，从杜仲叶中分离纯化的四个组分均为单一化合物，化合物FA-2为绿原酸，化合物FC-2为槲皮素-3-O-β-葡萄糖苷，化合物FC-3为槲皮素-3-O-乙酰葡萄糖苷、化合物FC-4为槲皮素。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1 杜仲叶的研究现状

1．1 杜仲简介

1．2 杜仲叶成分分析

1．3 黄酮类化合物的生物活性

1．4 杜仲叶研究现状

2 绿原酸、总黄酮的研究

2．1 含量测定

2．2 提取方法

2．3 分离纯化

2．4 结构鉴定

3 本课题研究的目的意义及主要内容

3．1 研究的目的及意义

3．2 研究内容

第二章 杜仲叶有效成分的提取

1 材料与仪器

1．1 材料

1．2 主要仪器和试剂

2 实验方法

2．1 绿原酸含量的测定

2．2 总黄酮含量的测定

2．3 样品含量的测定

2．4 杜仲叶提取工艺研究

3 结果与分析

3．1 回流法工艺优化

3．2 超声波法工艺优化

3．3 微波法工艺优化

3．4 验证试验

4 本章小结

第三章 杜仲叶粗提物的分离纯化

1 材料与仪器

1．1 材料

1．2 仪器与试剂

2 实验方法

2．1 高效液相色谱(HPLC)检测

2．2 大孔树脂初分离

2．3 聚酰胺树脂分离

2．4 Sphadex LH-20树脂纯化

3 结果与分析

3．1 大孔树脂静态吸附-解吸试验

3．2 动态吸附-洗脱试验

3．3 聚酰胺树脂分离

3．4 Sphadex LH-20树脂纯化

4 本章小结

第四章 杜仲叶中绿原酸、黄酮类化合物的结构鉴定

1 材料与仪器

1．1 材料

1．2 仪器与试剂

2 实验方法

2．1 薄层色谱(TLC)分析

2．2 紫外光谱(UV)分析

2．3 电喷雾源-质谱(ESI-MS)分析

2．4 核磁共振(NMR)分析

3 结果与分析

3．1 四个组分的TLC、UV分析

3．2 组分FA-2结构解析

3．3 组分FC-2结构解析

3．4 组分FC-3结构解析

3．5 组分FC-4结构解析

4 本章小结

全文讨论

全文总结

本论文创新点

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间学术论文发表