我国养殖卡帕藻Kappaphycus品系的分子鉴定与生理生态分析

摘要

卡帕藻Kappaphycus属于红藻门Rhodophyta、真红藻纲Florideophyceae、杉藻目Gigartinales、红翎菜科Solieriaceae、麒麟菜族Eucheumatoideae，是用于生产卡拉胶的重要热带海产经济红藻。多年的营养繁殖和近几年水域环境的日益恶化，使我国移植的卡帕藻属海藻资源受到了前所未有的破坏。由于原有藻体的抗病力下降，人们盲目地从异地频繁引进新种苗现象同益严重，并且养殖海域环境不同又造成藻体形态和颜色差异的状况，迫切需要对我国现有的养殖种类进行种类鉴定，对具有高产、高抗性等优良品种进行选育。为了持续、更好地发展、保护和利用这一重要经济资源，本文系统地研究了我国卡帕藻属养殖品系的分类及其生长和抗性等生理生态，具体研究内容及结果如下：
　　 1.卡帕藻的分子鉴定。通过随机引物扩增片段多态性(RAPD)和简单序列重复区间扩增多态性(ISSR)分析，对我国海南养殖的卡帕藻属海藻三种常见外形株系进行鉴定；在此基础上，进一步对我国海南、福建养殖的以及本实验室培养和保存的卡帕藻属海藻，通过核糖体内转录间隔区(ITS1-5.8S rDNA-ITS2，ITS)序列扩增和测序，并与细齿麒麟菜Eucheuma denticulatum比较研究，对其进行种质鉴定。结果表明：用RAPD与ISSR标记分析卡帕藻3个株系的遗传距离分别介于0.1229-0.1535与0.0688-0.1124之间，确定三个株系乃同一个种-长心卡帕藻Kappaphycus alvarezii;麒麟菜属和卡帕藻属的ITS序列具有明显差异，差异率高达58.72％-64.00％，遗传距离介于0.388-0.399之间；同属种间碱基差异率为7.02％-7.48％，差异主要存在于ITS1和ITS2区域，遗传距离介于0.042-0.045之间；种内碱基差异率为0.00％-0.31％，差异都出现在ITS2区域，遗传距离介于0.000-0.003之间。该研究证明了ITS序列可作为种内及种间亲缘关系鉴定的有效工具，不但可以明确区别卡帕藻属与麒麟菜属海藻，而且能有效地区别卡帕藻属内种间、种内及麒麟菜属种内差异，为麒麟菜族海藻的分子鉴定提供了一条新途径，为其遗传育种研究奠定了基础。
　　 2.卡帕藻的形态结构特征。以实验室培养的和我国海南、福建海区养殖的卡帕藻属Kappaphycus海藻为材料，观测了它们的外部形态、显微结构及部分超微结构。结果表明：卡帕藻属海藻呈绿色、黄绿色、绿褐色、红褐色、黄褐色和褐色等多种颜色；分枝互生、轮生、偏生或不规则，分枝术端尖细或圆钝，二叉、三叉或爪状；突起疣状、乳头状或刺状；内部都由表皮层、皮层和髓部组成，但是在细胞大小、排列上因种或品系而异。K. sp.与K.alvarezii的内部结构差异明显，K. sp.比K.alvarezii的中皮层细胞略大，皮层细胞的层数多，髓部细胞大，二者的外胶质层厚和表皮细胞大小相近。
　　 3.卡帕藻的卡拉胶等营养成分分析。对长心卡帕藻的养殖品系K.alvarezii(LD1)和K.alvarezii(XC1)的卡拉胶等营养成分进行了分析。结果表明K.alvarezii(LD1)和K.alvarezii(XC1)长心卡帕藻是高碳水化合物、低蛋白和低脂肪的海藻。碳水化合物含量分别为67.17％和66.40％，K.alvarezii(XC1)的卡拉胶含量是K.alvarezii(LD1)的1.76倍；K.alvarezii(LD1)和K.alvarezii(XC1)藻体中蛋白质含量分别为6.16％和3.09％，脂肪含量分别为0.48％和0.40％，必需氨基酸和不饱和脂肪酸含量高；矿质元素钙和钾含量丰富。
　　 4.卡帕藻的生态因子分析。在室内采用静置培养法研究了长心卡帕藻生长的适宜温度、光照强度和盐度，主要测定了不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃和32℃)、不同光照强度(30、65、110、150和200μmol.m-2s-1)和不同盐度(23、28、32、35和41‰)对卡帕藻的生长率、成活率、色素含量及其吸收光谱的影响。结果表明：长心卡帕藻的最适生长温度为25℃，20℃以下和30℃以上温度对其生长不利，藻体对短期20℃以下低温的耐受力比对30℃以上高温的耐受力强。红褐色品系长心卡帕藻适宜的光照强度和盐度范围分别为30μrnol.m-2s-1-65μmol.m-2s-1和28‰-32‰；最适光强和盐度分别为30μmol·m-2s-1和32‰。黄绿色品系长心卡帕藻适宜的光照强度和盐度范围分别为150μmol.m-2s-1-200μmol.m-2s-1和23‰-32‰；最适光强和盐度分别为150μmol·m-2s-1和23‰。不同温度、光照强度和盐度条件下培养，长心卡帕藻体内的色素含量会发生变化，而色素吸收光谱特性不变，色素含量与其生长率有或无明显的相关关系。该研究结果对我国卡帕藻的栽培生产，特别是室内培养研究具有一定的指导意义
　　 5.卡帕藻的耐温性分析。研究了K.sp.(LA2)、K.alvarezii(Lab1)和K. sp.(PT)3个卡帕藻养殖品系(分别记作A、B和C品系)对高温和低温的耐受性，确定了较耐高温和低温品系。分别测定10℃、15℃、20℃、25℃、32℃、35℃和40℃不同温度条件下海藻的硝酸还原酶(NR)和过氧化物酶(POD)活性、叶绿素(Chl)a和藻红蛋白(PE)含量，并采用调制叶绿素荧光技术，测定了32℃、35℃和40℃不同高温处理后3个品系的叶绿素荧光参数变化趋势。结果表明：高温对3个品系卡帕藻的NR和POD活性有显著影响，都表现出不同程度的活性升高，说明32℃以上高温不适于3个品系卡帕藻的生长，35℃以上高温对它们产生了明显的胁迫。高温对3个品系卡帕藻的光合色素造成了不同程度的破坏。在32℃～40℃条件下，随着温度的升高，A、B和C品系的实际光能转化效率(Y)和光合电子传递速率(ETR)明显下降，温度越高，下降程度越大；在32℃～40℃范围内，短期高温可刺激A品系的光合活性增强，但随着处理时间的延长，其光合活性下降，但差异不显著；在32℃～35℃范围内，短期高温可刺激B和C品系的光合活性增强，但随着处理时间的延长，二者的光合活性显著下降；A、B和C品系对40℃高温的耐受力低于35℃和32℃的。综合所有测定的生理指标，显示A品系对32℃以上高温的耐受力明显强于B和C品系。
　　 低温处理时，由NR和POD活性变化可见，3个品系卡帕藻对20℃以下低温均有一定抗性，C品系抗性最强。从两类色素含量的变化可见，A品系在低温条件下代谢水平下降，特别是15℃～10℃范围内其光合代谢水平明显下降；B品系在低温条件下代谢水平有补偿性增加，这种适应能力比A品系强，C品系的代偿性增加最强。因此C品系对20℃以下低温的耐受性明显强于B和A品系。本实验结果对藻类生理理论具有重要意义，为麒麟菜族海藻的良种选育奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文答辩委员会人员名单

引言

第一篇 卡帕藻的形态结构与分子鉴定

第一章 卡帕藻的分子鉴定Ⅰ:RAPD分析

第一节 RAPD-PCR的条件优化

第二节 卡帕藻的RAPD标记分析

第二章 卡帕藻的分子鉴定Ⅱ：ISSR分析

第一节 ISSR-PCR的条件优化

第二节 卡帕藻的ISSR标记分析

第三章 卡帕藻的分子鉴定Ⅲ: ITS分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第四章 卡帕藻的形态结构观察

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二篇 卡帕藻的生理生态研究

第五章 卡帕藻的营养成分分析

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 结论

第六章 卡帕藻的适宜培养条件研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第七章 卡帕藻养殖品系的耐温性分析

第一节 卡帕藻养殖品系的耐热性

第二节 卡帕藻养殖品系的耐冷性

小结

参考文献

攻读博士期间相关论文发表情况

致谢