利用多重PCR一次检测侵染大豆的几种检疫性病毒及大豆内源基因的研究

摘要

大豆作为世界上最为重要的一种经济作物，每年在各个国家都有大宗的贸易份额，在其生长过程中会受到多种真菌、细菌、病毒、线虫、昆虫等病原物的侵染。菜豆荚斑驳病毒(Beanpodmottlevirus，BPMV)、烟草环斑病毒(Tobaccoringspotvirus，TRSV)和番茄环斑病毒(Tomatoringspotvirus，ToRSV)均是危害大豆的重要病毒，也是我国的主要检疫对象，建立其多重PCR的快速检测体系，提高病毒的检测效率，为快验快放服务。
　　 本研究以带有BPMV、TRSV和ToRSV的大豆种子为实验材料，根据BPMV、TRSV、ToRSV的CP基因设计合成多对引物，然后进行单基因PCR反应特异性验证，同时选择大豆内源基因(BD30K)作为参照物，确保RNA提取、cDNA第一链合成及PCR等过程被正确操作，防止假阴性结果的发生。在此基础上合理组合各对引物并调整、优化多重PCR反应条件，最终确立了四对特异性引物和多重PCR的反应条件，选用的引物分别可扩增BPMV275bp，TRSV580bp，ToRSV794bp，BD30K104bp的特异性片段，反应条件则在普通PCR的基础上调整反应缓冲液浓度至1.4X，BD30K的引物浓度为其他引物的2倍，在此条件下我们建立了同时检测大豆种子中BPMV、TRSV、ToRSV及大豆内源基因BD30K的多重RT-PCR体系。
　　 研究结果表明，同步检测的特异性和灵敏度均好；能够检测到BPMV、TRSV、ToRSV和BD30K的RNA最低含量分别为0.9ng、0.186ng、8.0pg、3.8ng；携带三种病毒的大豆种子混合后提取的RNA的最低检测含量为1.16ng。表明建立的多重PCR检测方法特异性强，灵敏度高，可操作性强，大大缩短了检测时间，简化了操作步骤，具有较强的应用价值，适合口岸对进境大豆种子中这3种病毒的快速检测，在出入境检验检疫中具有广泛的应用前景。
　　 本研究还建立了大豆种子中BPMV和TRSV单管双重实时荧光PCR检测方法。将含有相同浓度的分别带有BPMV和TRSVCP基因的质粒溶液作为阳性对照，以受2种病毒侵染的大豆种子作为实验样品进行实时荧光PCR检测，结果表明能从同一管中同时检测出这两种病毒而不发生交叉反应。尽管在阳性对照中，二者的检测限相当，均可达到35pg/mL，但在实际应用中，两种病毒由于在大豆种子中的浓度不一致而存在一定的差别。同时将实时荧光灵敏度与DAS-ELISA和RT-PCR检测灵敏度进行比较，结果表明实时荧光PCR检测BPMV和TRSV的灵敏度分别是DAS-ELISA灵敏度的103、106倍；是双重RT-PCR灵敏度的100倍。可见双重实时荧光技术在病毒检测方面有着广阔的应用前景，同时该方法的建立在农业生产、种子流通及种子检验检疫中具有重大意义。