斑节对虾ANT基因与nm23基因的cDNA克隆及表达分析

摘要

斑节对虾(Penaeus monodon),是当前世界上三大养殖虾类之一,也是我国重要的对虾养殖种类之一。由于对其繁殖与成熟的许多机理仍然不是十分清楚,目前仍采用眼柄切除技术催熟雌虾。但这种催熟方法不利于亲虾的重复使用,且会引起亲虾的高死亡率,不利于斑节对虾养殖业的健康持续发展。因此,必须对斑节对虾性腺发育机制进行研究,发展新的有效的催熟技术,才能有效地提高亲虾的使用率和成活率,节约亲虾成本,促进斑节对虾养殖业的健康持续发展。而阐明斑节对虾性腺发育相关基因的分子调控机理是研制新的有效地催熟技术的重要途径。本研究克隆了与性腺发育调控相关的功能基因——腺苷酸转移酶与 nm23基因,并研究其表达调控及作用机理,为进一步开展斑节对虾性腺发育相关基因分子调控机理的研究提供基础资料。
　　1、本研究采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)获得了腺苷酸转移酶(adenine nucleotide translocase,ANT)的cDNA序列,命名为 PmANT。该序列全长1388bp,开放阅读框(ORF)为930bp,3’非编码区(UTR)为393bp,5’非编码区(UTR)为65bp。ORF可编码309个氨基酸,分子量为33.62kDa。与所有ANT家族成员一样,PmANT蛋白具有3个重复同源的线粒体跨膜结构域,但不含信号肽和糖基化位点。相似性、同源性及系统进化树分析显示,斑节对虾的ANT基因与凡纳滨对虾的同源性和相似性最高,并与其聚为一支。采用荧光定量的方法研究了 ANT基因在雌、雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的表达情况。结果表明:PmANT的mRNA在雌、雄个体的心脏、性腺、肌肉、眼柄神经、脑神经、淋巴、胃、肠、肝胰腺、鳃和血细胞中均有表达,其中在雄性个体的肌肉中表达量最高,其次为雌性肌肉,而在精巢的表达量最低,且未成熟精巢低于成熟精巢。PmANT的mRNA在卵巢的表达量高于精巢,且在Ⅲ期卵巢表达量最高,Ⅳ期最低。为今后进一步研究该基因在斑节对虾性腺发育中的作用提供基础材料。
　　2、本研究利用RACE技术获得了 nm23 cDNA序列。其 cDNA全长序列为769bp,5’非编码区105bp,3’非编码区208bp,开放阅读框(ORF)为456bp,编码151个氨基酸,分子量为17.01kDa。与许多 nm23家族成员一样,其只含有一个功能结构域:NDPk。利用SingalP4.0程序和NetNGlyc1.0在线程序发现,斑节对虾 nm23不含信号肽和糖基化位点。相似性、同源性及系统进化树分析显示,斑节对虾的nm23基因与凡纳滨对虾的nm23基因相似性和同源性最高,并聚为一支,其次为拟穴青蟹。采用荧光定量的方法研究了 nm23基因在雌、雄个体不同组织、卵巢不同发育阶段及未成熟和成熟精巢的差异表达情况。结果表明:nm23 mRNA在各组织中均有表达,其中,在雌虾的眼柄神经中表达量最高,其次为雄虾的未成熟精巢,且与其它各组织都存在极显著性差异。卵巢六期的时序表达结果显示,nm23 mRNA在卵巢的表达量由Ⅰ期到Ⅳ期逐渐增加,到Ⅳ期表达量最大,随后又逐渐降低。而在精巢中,其在未成熟精巢的表达量高于成熟精巢。在 nm23蛋白活性研究中,将编码 nm23成熟蛋白的PCR产物连接到质粒 pREST上构建重组表达载体 pREST-nm23,转化到大肠杆菌,经 IPTG诱导,产生融合蛋白 Rnm23。利用Ni2+-IDA亲和层析对 Rnm23进行纯化,得到纯化的蛋白,为进一步研究 nm23基因在斑节对虾性腺发育过程中的功能作用提供了基础材料。

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引 言

第一章 文献综述

1.1 对虾性腺的结构

1.2 与性腺发育相关的基因

第二章 斑节对虾腺苷酸转移酶（PmANT）基因的 cDNA 克隆与表达分析

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第三章 斑节对虾 nm23 基因的 cDNA 克隆及表达分析

3.1 材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

总结

附录-斑节对虾 MKK4 基因的表达分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

附录-缩略词表

附录-硕士期间发表的论文和参加的会议

致谢