鲢鱼葡萄糖-6-磷酸异构酶的基因克隆及表达分析

摘要

随着我国渔业的发展,水产品产量持续增加,鱼糜制品已成为淡水鱼加工利用的一个主要方向。但是,鱼糜制品生产过程中出现的凝胶劣化现象严重影响制品质量。本研究室已从多种鱼类肌肉中提取到肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(Myofibril Bound Serine Protein,MBSP),且发现该酶能催化肌原纤维产生降解作用,推测其与凝胶裂化现象密切相关。该酶的抑制剂肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶抑制剂(Myofibril Bound Serine Protein Inhibitor,MBSPI)现也已从多种鱼类中得到分离纯化,并证明其本质是葡萄糖-6-磷酸异构酶(Glucose Phosphate Isomerase,GPI),该抑制剂能有效抑制MBSP对肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MHC)的降解作用。海水白姑鱼的GPI对淡水鲤鱼的MBSP无抑制作用,同样淡水鲫鱼的GPI也不能抑制白姑鱼MBSP的活性,提示GPI对MBSP的抑制作用具有种属特异性。
　　本实验以鲢鱼为研究对象,以GPI的保守位点碱基序列为依据设计引物,利用RT-PCR方法并结合cDNA快速末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)得到了两条编码鲢鱼GPI的基因序列,命名为GPIA、GPIB,GenBank登录号分别为JF958124和JF907593,推导的氨基酸序列GenBank登录号分别为AEI61932和AEH76920。
　　GPIA的cDNA全长为2008 bp,开放阅读框为1662 bp,共编码553个氨基酸,推导分子量为62.12 kDa,等电点为6.27。GPIB的cDNA全长为2110 bp,开放阅读框也是1662bp,编码553个氨基酸,推导分子量为62.22kDa,等电点为6.82。GPIA和GPIB氨基酸序列相似性为83％,序列中均含有异构酶活性所必须的保守位点,其中Ser-159、Ser-209、Lys-210、Thr-211、Thr-214、Glu-357、Val-514、Leu-516直接与磷酸底物作用,Glu-216、Arg-272、His-388、Lys-518稳定整个催化活性中心结构。二者均不含信号肽,但均含有潜在的糖基化位点。
　　鲢鱼GPI的二级结构主要包括α螺旋、β折叠和无规则卷曲。用同源建模法分析鲢鱼GPI三级结构,发现鲢鱼GPI单体含有两个结构域,二者结构相似,都含有一个β折叠构成的中心,由α螺旋和无规则卷曲包裹,α-20和α-21构成一个钩子结构,C末端形成臂结构,这两种结构均有利于GPI与相邻的单体形成二聚体。GPI二聚体由两个亚基以非对称的方式团抱,各亚基延伸出的钩子及臂结构会环抱住另一亚基,这种“互相拥抱”的结构增进了GPI二聚体的结构稳定性。
　　系统进化分析发现硬骨鱼中含有两种GPI基因,其他脊椎动物都只含有一种GPI基因,在硬骨鱼中GPIA和GPIB又各自形成分支,因此可以认为GPI的基因分化晚于四足动物与鳍鱼的分化,但早于硬骨鱼的形成时期。
　　荧光定量PCR结果显示GPIA在成体鱼的各个组织中均有分布,且在肝脏和肾脏的表达量最高;GPIB主要存在于肌肉和心脏,而在白色肌肉组织中的含量又明显高于红色肌肉,GPI的这种组织分布性可能和其行使不同的生物学功能有关。

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第一章 引言

1.1 凝胶劣化现象

1.2 丝氨酸蛋白酶

1.3 丝氨酸蛋白酶抑制剂

1.4 葡萄糖-6-磷酸异构酶

1.5 cDNA末端快速克隆技术

1.6 鲢

1.7 本研究的目的与意义

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 生物信息学分析

2.4 实时定量PCR（Q-PCR）

第三章 结果与分析

3.1 总RNA提取

3.2 葡萄糖-6-磷酸异构酶基因克隆

3.3 葡萄糖-6-磷酸异构酶基因序列分析

3.4 GPIA、GPIB在不同组织的表达分析

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

参考文献

致谢

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