草鱼4个补体基因克隆表达和连锁及与细菌性败血症的关联分析

摘要

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国最主要淡水养殖对象,其产量一直位居我国和世界养殖鱼类第一。在养殖过程中草鱼病害频繁发生,各种传染性疾病的暴发每年都给草鱼养殖业带来了巨大的经济损失。开展草鱼免疫相关基因的功能研究,阐明其与抗病力的相关性,将为草鱼抗病分子育种提供重要的理论基础。本研究拟从克隆获得的草鱼补体Bf/C2、C6和C7基因入手,对其进行结构、连锁和组织表达分析,初步了解其生物学功能,并检测它们内部的基因多态性,进行不同基因型或单倍型与草鱼细菌性败血症的关联分析,以期筛选出有育种指导价值的优势基因型,取得的结果如下:
　　1.草鱼4个补体基因的克隆与表达
　　根据EST拼接成的连接群或斑马鱼的cDNA序列设计引物,从草鱼基因组中克隆到补体Bf/C2A、Bf/C2B、C6、C7基因的部分序列。采用RACE方法获得了4个补体基因的cDNA全长序列,并推导出相应的氨基酸序列,与其它物种的相同基因序列进行了比较分析。这4个基因cDNA序列已提交到GenBank数据库,登录号分别为JF47038,JF47039,HQ416903,JN655169。
　　采用Real-time PCR技术检测了补体Bf/C2A、Bf/C2B、C6、C7基因在健康草鱼成体组织、诱导后不同时点组织和不同发育时期的表达情况。结果显示,补体Bf/C2A、Bf/C2B、C6基因在所检测的12个组织中都有所表达,其中肝和脾中的表达量最高,但C7只有在头肾、中肾、皮肤、脾、心脏和肠中进行了表达。经福尔马林灭活嗜水气单胞菌诱导后,Bf/C2A、Bf/C2B、C6、C7基因在所检测的组织中出现了显著上调。补体C6 mRNA在未受精的卵中转录。孵化1d C6 mRNA转录显著上升,到第10d又开始下降,这表明补体C6在草鱼胚胎和鱼苗早期起到免疫保护的作用。
　　2.草鱼补体C6、C7基因的连锁分析
　　对补体C6、C7基因在作图家系4个亲本中进行多态性位点筛选,在补体C6基因第4号外显子上获得了1个SNP位点,在补体C7基因第5号内含子上发现了1个SNP位点。将这两个位点在两个作图家系192个子代中进行了基因分型,通过连锁分析发现补体C6、C7基因都位于草鱼第3号连锁群上,而且彼此紧密连锁,分布在微卫星标记CID0050和CID0190之间。
　　3.草鱼补体C6、C7基因的多态性与细菌性败血症的关联分析
　　采用人工感染嗜水气单胞菌的方法,建立了草鱼易感群体(186尾)和抗病群体(191尾),用于连锁分析。使用基因组步移法获得了补体C6、C7基因的启动子序列,分别为1130bp和1107bp。使用PCR方法获得了补体C6、C7基因组DNA全长分别为9288bp和7068bp,都包括18个外显子和17个内含子。
　　在草鱼C6基因中共发现了9个潜在的SNPs位点,其中编码区的1个同义突变位点,其余8个都分布在内含子上。对其中的8个位点在易感群体和抗病群体中进行了等位基因频率检测,没有发现单个SNP位点与败血症抗性有关联。连锁不平衡分析表明,其中G2638A、G2804C、A3519C、T3591C4个位点之间处于高度连锁状态(r2>80)。单倍型分析显示,共发现了13个单倍型,其中单倍型GCCC与细菌性败血症易感性显著相关(p<0.05,OR=1.45)。
　　在草鱼C7基因中共发现了7个潜在的SNPs位点,其中编码区的1个同义突变位点,启动子区1个突变位点,其余5个都分布在不同内含子上。对其中的6个位点在易感群体和抗病群体中进行了等位基因频率检测,发现SNP位点C1931T与败血症抗性显著相关(p=0.045和p=0.028)。连锁不平衡分析表明,其中A-69C、T819C、A2456T3个位点之间处于高度连锁状态(r2>85)。单倍型分析显示,共发现了8个单倍型,没有发现单倍型与细菌性败血症显著相关(p>0.05)。

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引言

第一章 文献综述

1.草鱼种质研究进展

2. 鱼类补体基因的研究进展

第二章 草鱼补体Bf/C2A基因的克隆与表达

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 草鱼补体Bf/C2B基因的克隆与表达

1 材料与方法

2 结果

3讨论

第四章 草鱼补体C6基因的克隆、表达与连锁分析

1 材料与方法

2结果

3 讨论

第五章 草鱼补体C7基因的克隆、表达与连锁分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第六章 草鱼C6基因多态性与细菌性败血症的关联分析

1 材料与方法

2 结果

3 结论

第七章 草鱼C7基因多态性与细菌性败血症的关联分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

附录：

致谢