切除眼柄对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)差异表达基因的影响及几种重要基因在不同卵黄发生阶段的表达量变化

摘要

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是我国主要养殖虾类之一。本实验利用抑制性消减杂交技术（SSH）构建了卵巢和肝胰腺在卵原细胞增殖期（第一期，切除眼柄前）与初级卵黄发生期（第三期，切除眼柄后）差异表达基因的文库。通过单克隆进行测序，测序结果与GenBank进行BLASTx与nucleotide BLAST进行同源性分析，利用NCBI数据库进行差异表达基因功能的注释，选取部分有代表性的差异表达基因进行荧光定量PCR，研究差异表达基因在卵巢和肝胰腺各个发育时期的表达情况。分析这些差异表达的基因与卵黄发生之间的关系。并且通过荧光定量PCR技术，专门研究了在不同卵黄发生阶段，主要差异表达基因以及卵黄蛋白原和血蓝蛋白在卵巢与肝胰腺中表达量变化，并分析它们与卵黄发生作用的关系。
　　研究结果表明，卵巢第一期差异表达基因为：极孔样蛋白、肌动蛋白、血小板反应蛋、及核自身抗原精子蛋白基因。卵巢第三期差异表达基因分别是；脂肪酸结合蛋白、二硫键异构酶、转醛醇酶、及血蓝蛋白基因。肝胰腺第一期差异表达基因是：ATP亚基、NADH亚基和铁蛋白基因。第三期差异表达基因有两个，分别是血蓝蛋白和卵黄蛋白原基因。
　　极孔样蛋白和卵黄蛋白基因在卵巢第一期和第三期均有表达，前者在第一期表达强烈，后者则在第三期有旺盛表达。基因表达状况与第一期卵母细胞分裂和第三期卵黄合成的生理活动密切相关。
　　荧光定量 PCR结果表明，极孔样蛋白（PH）、核自身抗精原蛋白(NA)、和血小板蛋白(THP)基因主要在卵巢表达。而且在切除眼柄前，这些基因的表达量都最高，随着卵巢发育，其表达量逐步下降，在第四-五期达到最低，其后稍有增加。PH、NA等基因的主要功能是信号传导和调控细胞分裂，因此卵巢发育前期，他们的表达相对较高，与卵巢发育的生理活动是紧密关联的。
　　利用荧光定量 PCR技术分别检测了血蓝蛋白与卵黄蛋白原 mRNA在卵巢和肝胰腺不同发育时期的表达量。结果显示，血蓝蛋白 mRNA主要在肝胰腺中表达，随着卵巢的发育，表达量呈增加趋势，至第三期达到高峰，其后稍有下降，但仍然维持在较高水平，在第六期降低到初始水平。而卵黄蛋白原 mRNA的表达量随着卵巢发育持续增加，在第五期达到最高，在恢复期才迅速下降。研究结果显示，血蓝蛋白的合成与卵巢发育呈现一定的相关性，血蓝蛋白是否直接或间接参与了卵黄发生和卵巢发育值得进一步探讨研究。

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前言

1.凡纳滨对虾养殖现状

1.1人工催熟——切除单侧眼柄

1.2眼柄激素的组成

2.卵巢的成熟——卵黄发生作用

2.1卵巢发育分期

2.2卵黄蛋白原合成部位的研究

3.血蓝蛋白功能的研究

4抑制性消减杂交技术

4.1抑制性消减杂交技术基本原理

4.2抑制性消减杂交技术在甲壳动物中的研究

5荧光定量PCR

6实验目的及意义

第一章 凡纳滨对虾卵巢和肝胰腺差异表达基因文库的构建

1.1材料与方法

1.1.1实验材料

1.1.2实验方法

1.2实验结果

1.2.1菌落PCR检测

1.2.2消减效率检测

1.2.2卵巢差异表达基因

1.2.3肝胰腺差异表达基因

1.2.4卵巢和肝胰腺特异基因

1.2.5卵巢和肝胰腺共有表达基因

1.3讨论与分析

1.3.1 主要差异基因

1.3.2 肝胰腺和卵巢在不同发育期的特异性表达基因

1.3.3 肝胰腺和卵巢在不同发育期的共有表达基因

第二章 部分差异表达基因mRNA在凡纳滨对虾卵巢不同发育时期的实时荧光定量PCR分析

2.1材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.2实验结果

2.2.1引物设计

2.2.2标准曲线与溶解曲线

2.2.3部分差异基因相对表达量

2.3讨论与分析

2.3.1三条基因的表达位点

2.3.2三条基因的变化趋势

2.3.3极孔样蛋白mRNA相对表达量变化与功能的分析：

2.3.2血小板反应蛋白mRNA相对表达量变化与功能的分析：

2.3.3核自身抗原精子蛋白mRNA相对表达量变化与功能的分析：

第三章 凡纳滨对虾卵黄蛋白原和血蓝蛋白mRNA在卵巢不同发育时期的半定量PCR和实时荧光定量PCR分析

3.1实验材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

3.2实验结果

3.2.1引物设计

3.2.2半定量PCR

3.2.3荧光定量PCR

3.3讨论与分析

3.3.1血蓝蛋白与卵黄蛋白原mRNA半定量分析

3.3.2卵黄蛋白原mRNA荧光定PCR的分析

3.3.4血蓝蛋白mRNA荧光定量PCR分析

结论

参考文献

致谢