草鱼呼肠孤病毒GZ1208株的分离、鉴定及全基因组序列分析

摘要

草鱼呼肠孤病毒（Grass Crap Reovirus，GCRV）是水生呼肠孤病毒属中毒力最强、我国淡水鱼养殖业危害最大的一种病毒，该病毒能引起草鱼发生出血病导致大量死亡而给我国的草鱼养殖业造成非常大的经济损失。病原学复杂、毒株变异大、缺少针对性防控措施是导致该疫病持续流行的主要原因。至今，已报道的分离株有30多株，各分离株在细胞培养特性、毒力、基因组带型、基因序列等各方面均存在较大的不同。 2012年8月，广州白云区某草鱼养殖场疑似发生出草鱼出血病疫情，患病草鱼主要临床症状为肠道出血严重，肠炎症状明显，鳃充血呈红色，其它部位症状不明显。采集病鱼的肠道、肝脏、脾脏和肾脏组织，剪碎研磨制备组织匀浆液接种草鱼吻端成纤维细胞（ProboscisSnout intoFibers，PSF）细胞进行病毒分离，盲传至第二代开始出现致细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE)。用感染病毒的PSF细胞制备电镜负染切片，电镜下观察到呈六边形，无囊膜，大小约70nm呈晶格状排列的病毒粒子。同时通过采用三重 RT-PCR检测方法对采集的组织和接毒后的PSF细胞培养液进行病毒检测，在肠、肝、脾、肾脏及细胞培养液中均扩增出约500bp左右的单一条带，组织中以肠道的条带最明显。对RT-PCR检测结果为阳性的产物进行测序，测序结果进行BLAST比对，结果显示，与GCRV873株和GSRV的核苷酸序列相似性分别为93%和92%。将PSF细胞增殖后的病毒液超速离心进行浓缩，提取浓缩后的GCRV基因组，进行SDS-PAGE电泳带型分析，结果发现，新分离毒株11个条带，和I型的873毒株的带型比较接近，只是3个大片段存在差异。结合临床症状、细胞感染实验、电镜观察、RT-PCR检测结果、基因序列同源性、全基因组 SDS-PAGE电泳带型，初步鉴定分离到的毒株为一株新的草鱼呼肠孤病毒，暂时把它命名为GCRV GZ1208。 将Z1208种毒接种PSF细胞，采用TCID50测定方法来测定该分离株接种PSF细胞后的病毒滴度，结果为10-8.5/0.1mL。用浓度为10-3.5/0.1mL TCID50的病毒液感染稀有鮈鲫和一月龄草鱼进行回归感染试验，回归感染2周后未死亡的鱼，以不同基因型的强度毒株攻毒，进行交叉免疫保护试验。回归感染试验表明，稀有鮈鲫和草鱼感染GZ1208毒株后感染率均为100%，但死亡率分别为43.3%和35%；交叉免疫保护试验表明，GZ1208毒株对II型强毒株HuNan1307没有免疫保护效果，但对I型毒株JX-01有较好的保护效果。 参考GCRV其它分离株基因组序列设计引物，RT-PCR扩增和克隆了GZ1208毒株的全部基因节段，并测定了其全全因组序列。GZ1208基因组全长为23.696Kb，S1至S11节段的大小分别为3949bp、3877bp、3702bp、2320bp、2239bp、2039bp、1414bp、1297bp、1130bp、909bp、820bp。用DNAStar、ORF Finder软件和GenBank数据库对测定的全基因组序列进行基因组特征、编码氨基酸、同源性等进行分析，并基于各个节段编码的多肽序列制作系统发育树。结果表明，GZ1208基因组各节段在末端均有保守序列，大部分节段的都是5’GUUAUUU…UUCAUC3’。GZ1208各节段核苷酸序列与104毒株（III型）相应节段的相似性在32.4%至50.6%之间，与HZ08（II型）毒株的相似性为38.4%至52.8%之间，与AGCRV的相似性在52.3%至69.1%之间，与873（I型）毒株的相似性在90.7%至98.3%之间，与GSRV的相似性在91.5%至99.2%之间。基于各个节段基因编码的多肽序列建立的系统进化树表明，GZ1208株与873株和GSRV聚为同一支。序列同源性比较显示，GZ1208株S5节段与873株的S5同源性较高，而与GSRV则相对较低，而在S9节段与GSRV核苷酸序列的同源性显著高于GCRV873，这个现象表明，该分离株可能是不同毒株通过重配形成的一个新分离株。 综上所述，GZ1208为一株草鱼呼肠孤病毒新分离株，与873株同属I型GCRV。其基因组带型和基因组特征与I型的代表株GCRV873和GSRV相似性最高，核苷酸和多肽序列相似性比较结果显示，GZ1208一些节段与873株相似性最高，而另一些节段与GSRV的相似性最高，推断新分离的GZ1208毒株可能是不同毒株之间通过重配形成的新毒株，该研究不但丰富了 GCRV病毒库和全基因组序列数据库，而且也为GCRV遗传变异规律的研究奠定基础。

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第一章 前 言

1 草鱼出血病及其病原

2 病毒形态及生化特征

3 基因分型与流行病学

4 细胞培养特性

5 基因组序列

6 基因组特征及各基因节段编码的多肽

7 检测方法

8 草鱼出血病防控

9 本研究目的和意义

第二章 草鱼呼肠孤病毒GZ1208的分离与鉴定

1 材料和方法

1.1 实验鱼、样品、细胞和毒株

1.2 主要试剂和仪器

1.3 患病草鱼样品收集

1.4组织匀浆液制备

1.5 病毒分离

1.6电镜切片制作

1.7 三重RT-PCR检测

1.8 扩增产物测序与比对

1.9病毒浓缩

1.10病毒基因组提取

1.11 基因组带型分析

1.12 病毒滴度测定

1.13 回归感染试验

1.14 交叉免疫实验

2. 结果

2.1 发病草鱼症状

2.2 6天内PSF细胞感染病毒后的形态变化

2.3 电镜下的病毒粒子

2.4 三重PCR电泳带型

2.5 扩增片段与873序列比较

2.6 SDS-PAGE电泳带型

2.7 病毒滴度测定

2.8 回归感染实验

2.9 交叉免疫实验

3. 讨论

第三章 全基因组序列测定与特征分析

1. 材料与方法

1.1实验细胞、毒株及所用软件

1.2 主要试剂和仪器

1.3 引物设计

1.4 序列扩增与测序

1.5 序列拼接

1.6 基因组特征

1.7 序列相似性分析

1.8 编码氨基酸分析

1.9 氨基酸相似性分析

1.10 系统进化树构建

2. 结果

2.1 全基因组序列

2.2 基因组特征

2.3 编码氨基酸

2.4 各节段的核酸序列相似性比较

2.5 各节段的氨基酸序列相似性比较

2.6 系统进化树

3. 讨论

全文总结

参考文献

硕士期间发表的论文：

致谢