虾、贝类水产品中细菌多样性分子特性的研究

摘要

本研究以2014年8-11月采集于上海水产品市场的6种虾和11种贝类水产品为研究对象，包括斑节对虾(Penaeus monodon)、日本沼虾(Macrobrachium nipponense)、凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)、斑节虾(Marsupenaeus japonicas)、喇蛄(Procambarus clarki)、口虾蛄(Oratosquilla oratoria)、海螺(Busycon canaliculatu)、虹光亮樱蛤(Moerella iridescens)、皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)、毛蚶(Scapharca subcrenata)、血蚶(Tegillarca granosa)、花蛤(Ruditapes philippinarum)、中华圆田螺(Cipangopaludina chinensis Gray)、扇贝(placopecten magellanicus)、贻贝(Mytilus edulis)、油蛤(Tathia undulota)和波纹巴非蛤(Paphia undulate)，运用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel eletrophoresis，PCR-DGGE)和高通量Illumina Miseq III测序技术，首次对上述17种样品的细菌群落结构与组成进行了研究。结果显示，供试的17种样品的 PCR-DGGE指纹图谱差异明显，其中，斑节虾、日本沼虾、中华圆田螺、海螺和花蛤的指纹图谱的条带数量、亮度明显高于其它供试样品。基于16S rRNA基因的Illumina MiseqIII测序分析，共计获得501,197条高质量序列，其中318,422条序列来自贝类样品，182,775条序列来自虾类样品。获得序列的生物信息学和统计学分析结果显示，变形菌门(Proteobacteria)在虾类(39.4%-98.2%)和贝类(50.9%-96.5%)样品中均为优势菌门。弧菌属(Vibrio)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、弓形杆菌属(Arcobacter)、气单孢菌属(Aeromonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和Psychrilyobacter是存在于11种贝类样品中的高丰度菌属(3.50%-89.3%)；而弧菌属、假交替单胞菌属、发光杆菌属(Photobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、气单孢菌属和不动杆菌属(Acinetobacter)是6种虾类样品中的高丰度菌属(3.43%-78.24%)。另外，序列分析结果还显示贻贝样品的细菌群落多样性最高，扇贝最低；淡水养殖的日本沼虾和喇蛄的细菌群落多样性和丰度均高于四种海水养殖虾、贝类样品(口虾蛄、斑节虾、斑节对虾和凡纳对虾)；一些潜在的致病菌，例如弧菌属、气单孢菌属等在虾和贝类样品中均有检出。 此外，本研究还从虾、贝类水产品样品中分离、鉴定了208株副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)菌株，并对其毒力、抗菌素以及重金属抗性特性进行了研究。水产品样品包括：斑节对虾(P. monodon)、日本沼虾(M. nipponense)、凡纳对虾(L. vannamei)、斑节虾(M. japonicas)、蝲蛄(P. clarkia)、海螺(B. canaliculatu)、虹光亮樱蛤(M. iridescens)、皱纹盘鲍(H. discus)、毛蚶(S. subcrenata)和血蚶(T. granosa)。利用 PCR技术检测副溶血性弧菌分离菌株的毒力、耐药以及整合接合元件(ICEs)相关基因；采用美国临床与实验室标准研究所(CLSI)标准Kirby-Bauer纸片扩散法以及最小抑菌浓度法测定受试菌株的抗菌素和重金属抗性。结果显示：受试菌株均不含有编码耐热直接溶血素(TDH)的基因tdh；可是，6株副溶血性弧菌含有TDH相关溶血素(TRH)基因trh(2.9%)。受试的208株副溶血性弧菌对六大类十种抗菌素的耐药性存在显著差异，其中氨苄青霉素的耐药率最高为94.2%，其次为利福平(93.3%)和链霉素(77.9%)；卡那霉素、大观霉素和庆大霉素的中介耐药率分别为89.4%、88.9%和53.4%；氯霉素、四环素和复方新诺明的敏感率分别为100%、95.2%和94.7%；74.52%的受试菌株检测为多药抗性(MDR)表型。另外，89.4%、80.3%和80.3%的受试菌株分别对铜、铅和镉具有高度抗性。此外，11株分离自虾类样品的受试菌株携带SXT-R391家族ICEs相关核心基因(Int、traI、traC、setR)；22.6%受试菌株含有质粒。本研究还检测了47株携带质粒的副溶血性弧菌的3种抗菌素耐药相关基因，结果显示：磺酰胺类抗性相关基因sulII的检出率为4.3%；氨基糖苷类抗性相关基因 strA和 strB检出率分别均为4.3%；氨基糖苷类抗性相关基因aadA的检出率为6.4%。 综上所述，本文研究结果为我国虾、贝类水产品中微生物生态，以及水产食品安全风险评估提供了数据支撑。

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第一章 绪论

1.1我国虾、贝类水产品生产现状

1.2微生物多样性分析技术进展

1.3副溶血性弧菌的生物学特性与危害

1.4水产养殖生态环境的污染

1.5细菌抗生素抗性转移的可能机制

1.6本文研究目的及意义

第二章 贝类水产品中细菌群落结构与组成分子特性的研究

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3结果与分析

2.4讨论

2.5结论

第三章 虾类水产品中细菌细菌群落结构与组成分子特性的研究

3.1 实验材料

3.2 试验方法

3.3结果与分析

3.4 讨论

3.5 结论

第四章 虾和贝类水产品中副溶血性弧菌的毒性、抗生素和重金属抗性的研究

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3结果与分析

4.4 讨论

4.5 结论

第五章 展望和不足

参考文献

攻读硕士学位期间发表的文章及参加的学术会议

致谢