尼罗罗非鱼Ly75基因的克隆、原核表达和多克隆抗体制备

摘要

淋巴细胞抗原75（Ly75）是一种Ⅰ型跨膜表面蛋白，属于C型凝集素超家族中甘露糖受体家族成员。已有研究表明Ly75在鱼类的性腺中表达量比较高，且只在特异的生殖细胞中表达。为了解Ly75在尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotcus)中的功能，本研究采用RACE技术克隆了尼罗罗非鱼Ly75基因（OnLy75）的cDNA全序列，运用qPCR技术分析了该基因在健康尼罗罗非鱼中的组织分布。并构建了其原核表达载体，获得了具有免疫原性的OnLy75重组蛋白，用重组蛋白免疫新西兰大耳白兔后获得了兔抗OnLy75多克隆抗体。另外，还运用原位杂交技术定位了该蛋白在尼罗罗非鱼精巢组织的具体表达位置。主要研究结果如下：
　　1.尼罗罗非鱼Ly75基因的克隆和组织表达
　　以NCBI上OnLy75的预测序列为模板设计引物，获得中间片段序列，采用RACE技术克隆OnLy75基因的cDNA全序列。成功获得了6632 bp的OnLy75 cDNA全序列，其开放阅读框长5199 bp，编码1732个氨基酸。ProtParam软件分析OnLy75蛋白的理化性质，结果显示其蛋白分子量为196.5千道尔顿（kDa），理论等电点为6.41，不稳定指数是38.17，属于稳定蛋白；亲水性平均指数为-0.476，属于亲水性蛋白。SMART软件在线分析OnLy75蛋白的保守结构域从N端到C端依次为：一个CysR、一个FNⅡ、十个CTLDs和一个TM。氨基酸序列同源性分析表明，OnLy75与金枪鱼Ly75的同源性最高（相似性86.0％，同一性64.9%），与其他鱼类也有较高的同源性（相似性75.3%~85.0%，同一性49.3%~62.3%）。NJ系统进化树分析显示OnLy75分布于Ly75分支，属于甘露糖受体亚家族成员。
　　qPCR分析OnLy75基因在健康尼罗罗非鱼组织中的表达，结果显示OnLy75在所检测的各组织中都有表达且表达差异明显。其中在精巢组织表达量最高，其次是肠道、胸腺、后肾、鳃、脾脏、头肾、中肾和脑，在心脏、肌肉和卵巢表达量较低，而表达量最低的是皮肤和肝脏组织。
　　根据所得的OnLy75 cDNA序列，设计引物，制备了用于原位杂交的Ly75正义探针和反义探针。利用切片原位杂交技术，分析了OnLy75在精巢组织中的表达位置。
　　2.尼罗罗非鱼Ly75的原核表达及多克隆抗体制备
　　选取OnLy75抗原性良好的多肽序列，设计构建原核表达载体的引物，以8.5日龄的尼罗罗非鱼总cDNA为模板，扩增构建OnLy75原核表达片段，将其连接到原核表达载体pEASY-E2中构建重组表达质粒pEASY-E2-OnLy75。将重组质粒转到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，用IPTG进行诱导表达，诱导表达条件为IPTG0.5 mmol/L、37℃、诱导表达5 h。诱导表达后SDS-PAGE检测发现OnLy75重组蛋白主要存在于包涵体中。用纯化后的OnLy75重组蛋白多次免疫新西兰大耳白兔后，取抗血清，经亲和纯化后获得兔抗 OnLy75多克隆抗体。使用该多抗对尼罗罗非鱼不同器官进行Western blot内源性检测，结果显示该蛋白在精巢中有丰富的表达，表明兔抗OnLy75多克隆抗体制备成功。

目录

声明

引言

1 甘露糖受体家族简介

2 Ly75的研究进展

3 本研究目的意义及技术路线

第一章 尼罗罗非鱼Ly75基因的克隆及组织表达分析

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二章 尼罗罗非鱼Ly75基因的原核表达和多克隆抗体制备

1 材料

2 实验方法

3 结果与分析

4 讨论

小结

参考文献

附录

附录一 课题资助情况：

附录二 论文发表情况：

附录三 参加会议情况:

致谢