两种腹毛目纤毛虫不同时期微管胞器和微管蛋白的比较研究

摘要

与多细胞生物相比，单细胞的纤毛虫具有更复杂的微管结构，许多研究将微管类胞器作为原生动物细胞学和细胞生物学的重要内容，并采用各种方法来显示这些微管类结构。但长期以来，一直没有专门显示微管结构的好方法。传统上，采用银浸法来显示纤毛虫的毛基体，但获得的结构并不清晰；通过蛋白银方法呈现纤毛及其附属结构，但无法显示细胞内层的微管系统。为了进一步了解无性分裂过程中纤毛虫微管类骨架分化的结构特征和成分，本文以红色伪角毛虫(Pseudokeronopsisrubra)和急纤虫(Tachysoma)为研究对象，利用FLUTAX直接标记法、α、γ-微管蛋白抗体间接标记法研究这两种纤毛虫在无性生殖过程中微管类胞器的发生和微管蛋白的分布：利用Westernblotting实验技术对两种腹毛目纤毛虫的α、β、γ-三种微管蛋白进行分析比较。所得的结果如下： 1.两种腹毛目纤毛虫不同时期的微管骨架FLUTAX直接标记法有效地显示了红色伪角毛虫和急纤虫细胞的微管类胞器和相关结构微管的形态及其在形态发生中的变化。结果显示在无性生殖过程中两种纤毛虫腹部纤毛器包括口围带、波动膜、额腹横棘毛和缘棘毛经历了瓦解过程，在细胞皮层的特定位置经历了新纤毛器的形态发生过程，从相应纤毛器原基的发生、组排和迁移，至最终形成前、后两套新的纤毛器，新结构的形成和老结构的瓦解是一个相伴随的过程。两种纤毛虫口器的发生存在差异：在红色伪角毛虫中，新的口围带原基发生于老口围带和残剩的老波动膜之间，老口围带自基部向前瓦解时，口围带原基将无秩序毛基体组装成小膜，并发生迁移，替代老口围带；急纤虫中，新口围带结构在老口围带位置替换老结构，老口围带被吸收，新口围带在老口围带基部产生。背面纤毛器的发生中，红色伪角毛虫新纤毛原基在老纤毛基体后发生，最终形成前、后两套新背触毛代替老结构；急纤虫中，部分背触毛列的发生与红色伪角毛虫一致，但另几列背触毛原基在邻近背触毛列的一定位置形成，在虫体演化过程中转化成为新仔虫的背触毛列，与老结构无关。 2.两种腹毛目纤毛虫微管胞器的免疫荧光观察应用荧光显微术显示经α、γ-微管蛋白抗体标记的分裂期和非分裂期红色伪角毛虫和急纤虫细胞皮层微管胞器，观察到非分裂期和分裂期红色伪角毛虫经α-微管蛋白抗体标记后，细胞皮层的纤毛基体和纤毛杆整体结构有荧光反应，细胞经γ-微管蛋白抗体标记后，皮层纤毛器基部的纤毛基体有荧光反应。分裂期和非分裂期的一种急纤虫经α-微管蛋白抗体标记后，观察到作为微管主要组分的α-微管蛋白稳定地存在于纤毛结构中，细胞经γ-微管蛋白抗体标记后没有特异性荧光反应。结果表明：作为微管主要组分的α-微管蛋白稳定地存在于纤毛整体结构中，但γ-微管蛋白可能主要存在于纤毛基体中。 3.免疫印迹检测两种腹毛目纤毛虫的微管蛋白为初步分析红色伪角毛虫和急纤虫体内α-、β-、γ-三种微管蛋白的分子量及含量，鉴定在免疫荧光标记实验中所采用的微管蛋白抗体的特异性，进一步验证其实验结果的可靠性，利用Westernblotting实验技术对两种腹毛目纤毛虫的α-、β-、γ-三种微管蛋白进行分析比较。本实验中用到的一抗包括：鼠抗α-微管蛋白抗体，鼠抗β-微管蛋白抗体，鼠抗γ-微管蛋白抗体和兔抗γ-微管蛋白抗体。实验结果显示：α-、β-微管蛋白分子量均为55KD左右，在纤毛虫体内表达稳定，且与抗体特异性结合较好；两种γ-微管蛋白抗体对细胞体内的γ-微管蛋白标记都不是很清晰，其中，鼠抗γ-微管蛋白抗体标记较弱，几乎看不到明显的目的条带，而兔抗γ-微管蛋白抗体非特异性条带太多，也没有分析价值。Westernblotting结果进一步验证了作者前面的假设，即由于抗体本身的特异性差异，所以在α、γ-微管蛋白抗体免疫荧光标记实验中，α-微管蛋白抗体标记效果明显比γ-微管蛋白抗体标记效果清晰。如同其他原生动物一样，纤毛虫是一个多系统类群，而并非是一个自然类群，纤毛虫所表现的细胞多样性特征是研究生物多样性及其真核细胞中胞器起源和细胞进化的重要依据。本文对腹毛目纤毛虫一种进化程度较低的红色伪角毛虫和一种进化程度较高的急纤虫的上述研究结果，不仅有助于深入了解这两种纤毛虫的系统地位，并且为进一步揭示腹毛目纤毛虫的进化等问题提供了有价值的基础资料。

目录

文摘

英文文摘

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第一章纤毛虫细胞骨架的研究(综述)

第二章两种腹毛目纤毛虫不同时期微管骨架的显示

第三章应用α、γ—微管蛋白抗体标记两种腹毛目纤毛虫微管胞器的免疫荧光观察

第四章免疫印迹检测两种腹毛目纤毛虫微管蛋白及其抗体特异性

参考文献

在攻读硕士期间参加的科研项目及撰写的论文

致谢