冬眠和非冬眠蝙蝠瘦素蛋白的结构与功能研究

摘要

瘦素(leptin)是一种由脂肪细胞分泌的激素类蛋白，分子量约为16 kDa，通过与下丘脑下端的瘦素受体结合，激活下游酪氨酸蛋白激酶(Janus kinases，JAK)和转录信号转导物及激活剂(signal transducers and activators of transcription，STAT)等途径，抑制机体摄食和调节能量代谢，控制机体能量代谢平衡。有研究表明，瘦素在哺乳动物冬眠过程中具有重要调控作用。本研究中我们分别选择一种冬眠蝙蝠马铁菊头蝠(Rhinolophus ferrumequinum)和一种非冬眠蝙蝠棕果蝠(Rousettus leschenaultii)为实验材料，调取两种蝙蝠瘦素基因全长序列；随后，将瘦素基因编码区克隆至表达载体转入大肠杆菌中，在离体情况下实现了两种蝙蝠瘦素蛋白质的原核表达、纯化，通过SDS-PAGE实验、免疫印记实验和生物活性实验对所得到的瘦素蛋白进行验证，并比较了两种瘦素蛋白在氨基酸序列、同源模拟的3D蛋白结构以及离体条件下生物活性的差异。实验中发现：(1)冬眠蝙蝠瘦素蛋白与非冬眠蝙蝠相比，其氨基酸序列相似度较低；同时，冬眠蝙蝠瘦素蛋白与其它非冬眠哺乳动物相比，其氨基酸序列相似度也较低。(2)与非冬眠蝙蝠相比，冬眠蝙蝠瘦素对前脂肪细胞(3T3-L1 cells)具有更强的生长抑制作用。(3)在结构模拟中发现，两种蝙蝠瘦素的受体结合域三(receptor binding siteⅢ)(螺旋C至D处)结构差异大，且瘦素介导JAK/STAT通路的重要位点121位点处马铁菊头蝠由疏水性的甲硫胺酸变为亲水性苏氨酸，而瘦素的受体结合域三及瘦素蛋白121位点是启动下游信息传导的重要区域。非冬眠蝙蝠瘦素与人瘦素一样，在受体结合域三位置的结构是随机环(random loop)，而冬眠蝙蝠的瘦素为螺旋结构(helix)。以上研究初步证明了冬眠动物瘦素蛋白和非冬眠动物的瘦素蛋白具有不同的氨基酸序列、蛋白空间结构以及生物活性，为进一步深入研究瘦素在冬眠过程中的具体作用机制打下了基础。