人类RPK118基因的功能研究

摘要

由于发现1999年报道的RPS6KC1基因在肝癌组织中上调表达，本文拟对其生理功能进行详细研究。通过EST电子信息步移的方法，在GenBank数据库中检索到了若干位于5’侧的新ESTs序列，经重新拼接得到了新的全长cDNA序列，然后我们从人脑cDNA文库中克隆到了全长的RPS6KC1cDNA，测序证明所克隆的cDNA与来自ESTs拼接的序列完全一致。为了证明RPS6KC1蛋白的客观存在并为进一步研究该蛋白的功能提供材料，我们在原核细胞中重组表达了RPS6KC1表位抗原区的肽段，并用其制备了RPS6KC1的多克隆抗体。用哺乳动物细胞表达了RPS6KC1的全蛋白，并以MBP(MylineBindingProtein)以及S6肽段为底物，检测了RPS6KC1的蛋白激酶活性，但未能获得阳性结果。虽然RPK118蛋白没有激酶活性，但日本学者发现它能够与鞘氨醇激酶互作，并且可共定位于内涵体上，我们用酵母双杂交、Pull-Down和免疫共沉淀等方法发现PRK118能够与一个已知定位于线粒体的抗氧化蛋白PRDX3互作，并且它也能把PRDX3共定位到内涵体上。经过一些列研究发现，RPK118的PX结构域是参与内涵体定位的区域，而其激酶结构域可能是PRDX3的互作区。这一细胞水平的观测结果为我们随后的免疫共沉淀实验结果所证实。综上所述，虽然PRDX3被公认是定位于线粒体中，但我们的研究结果却表明，它还可通过RPK118的介导进入内涵体发挥作用。内涵体是一种可运送多种内吞物质到溶酶体中降解的细胞器，尽管目前我们尚不知PRDX3在内涵体中发挥何种作用，但它本身所具有的抗氧化、抗氧自由基的功能对于内涵体中的物质必定会产生某种生理效应，随着我们研究工作的深入，RPK118介导PRDX3进入内涵体这个新发现的科学意义将会逐渐显现出来。

目录

论文说明：指导小组成员

前言

材料和方法

一、材料

1.1cDNA文库

1.2质粒载体

1.3菌株与实验动物

1.4克隆和载体构建的实验材料和试剂盒

1.5酵母双杂所用实验材料及试剂

1.6细胞培养及免疫共沉淀所用材料与试剂

二、主要的仪器设备

三、方法

3.1克隆和载体构建

3.2 LexA-RPK118酵母表达载体转化酵母感受态细胞

3.3自激活测定

3.4人类肝cDNA文库转化酵母细胞

3.5酵母双杂交系统阳性克隆的鉴定

3.6酵母双杂交系统阳性克隆的验证

3.7细胞培养的方法

3.8哺乳动物细胞中的免疫共沉淀实验

3.9 GST融合蛋白Pull Down实验

3.10免疫荧光实验

3.11原核表达pET32a-B和pET32a-C

3.12抗体的制备和纯化

3.13体外磷酸化实验

3.14亚细胞组分分析

四、技术路线

结果

一、人类RPK118全长cDNA的克隆及序列分析

1.1人类RPK118 cDNA全长克隆及鉴定

1.2RPK118基因的染色体定位

1.3RPK118基因编码蛋白的功能结构域预测

1.4预测RPK118蛋白上的修饰位点

1.5 RPK118基因的组织表达谱以及在肿瘤中的表达变化

二、RPK118多克隆抗体的制备

三、酵母双杂交筛选RPK118的互作蛋白

四、PRDX3与RPK118相互作用的验证

4.1在293T细胞中，PRDX3能和RPK118相互结合

4.2 GST-PRDX3能Pull-down细胞裂解液中的Myc-RPK118

4.3 293T与COS7细胞中PRDX3与RPK118共定位

五、RPK118与PRDX3的互作部位分析

六、RPK118对PRDX3不具有体外磷酸化作用

七、RPK118的亚细胞定位及其对PRDX3定位的影响

7.1RPK118定位于早期内涵体上

7.2 COS7细胞中PRDX3定位于线粒体上

7.3天然状态下PRDX3仅有少量分布于早期内涵体上

7.4 PX结构域对RPK118的早期内涵体定位是必需的

7.5 RPK118召集PRDX3进入早期内涵体

7.6 RPK118的PX结构域对PRDX3的内涵体定位至关重要

八、COS7细胞的亚细胞组分分析

讨论

小结

参考文献

附录

综述：PX蛋白的研究进展

致谢

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