提高和延长裸DNA介导的人凝血Ⅸ（hFⅨ）在小鼠中的表达及M13的噬菌体基因转移体系的研究

摘要

(一)裸质粒作为基因表达及基因治疗载体,与病毒载体相比有许多突出的优点,但如何提高和延长裸DNA注射介导外源基因转移效率和表达成为该研究领域目前的主要任务.我们首先系统的研究了氯喹对裸质粒介导的人凝血Ⅸ因子在小鼠体内表达的影响.通过尾静脉液压法介导裸质粒转移体系,将含有10μg pCMV-hFⅨ质粒和不同浓度氯喹(100μmol/L,200μmol/L,500μmol/L)的Ringer's液2.2mL,6-7秒内注射到小鼠体内.在不同的时间,检测小鼠血清中hFⅨ的表达水平及对肝脏的损害.200μmol/L氯喹处理组小鼠血清中hFⅨ表达水平最高,注射后8小时表达量为4.4±1.8μg/mL,24小时达到9.7±1.6μg/mL是对照组的3-4倍.3天后各处理组的hFⅨ表达水平没有显著性差异.病理切片和转氨酶水平检测都表明氯喹对小鼠肝脏没有明显毒副作用.实验结果表明一定浓度的氯喹能安全,有效的提高hFⅨ在小鼠体内的表达.另外我们还探索了去除细菌骨架序列的编码人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)的线状片段DNA(LF DNA)、不同启动子、ITR及单双链对hFⅨ在小鼠中表达的影响.(二)Tat蛋白和RGD-4C分别与M13噬菌体的pⅧ和pⅢ融合表达,并在噬菌体基因组中插入由CMV启动子调控的绿色荧光蛋白基因GFP的真核表达框架.用这两种重组M13噬菌体转染细胞,观察GFP表达情况,进而评估Tat蛋白和RGD-4C重组噬菌体作为运载外源基因载体的可行性及存在的问题,为噬菌体应用于基因治疗奠定基础.

目录

缩写词

Abstract

第一部分

1.氯喹对人凝血因子Ⅸ在小鼠体内表达的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

2、质粒构像及调控元件对hFⅨ基因表达的影响和血友病B小鼠基因治疗研究

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分M13噬菌体介导的哺乳动物细胞基因转移的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考资料

综述：裸DNA转移系统在基因治疗中的应用

致谢

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