脂多糖激活大鼠肺微血管内皮细胞上Toll样受体4介导的信号转导和辛伐他汀的干预研究

摘要

第一部分 大鼠肺微血管内皮细胞上Toll样受体4的表达和其介导的信号通路的研究 【目的】脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌(GNB)细胞壁上的主要成分，在GNB感染导致的急危重症急性呼吸窘迫综合症(ARDS)中扮演重要角色。经典的理论是LPS和免疫细胞上Toll样受体4(TLR4)结合，介导免疫反应。但是有证据表明TLR4也分布在某些非免疫细胞上，这些细胞也能够被L2S激活，通过分泌炎性细胞因子，调节免疫反应，参与病理过程。本文探讨在大鼠肺微血管内皮细胞上是否存在TLR4表达和LPS激活的TLR4介导的信号通路，为ARDS的发病机制和治疗提供理论依据。 【方法】体外培养大鼠肺微血管内皮细胞，应用Ⅷ因子相关抗原间接免疫荧光染色法进行鉴定。用RT-PCR测定各种Toll样受体家族成员在大鼠肺微血管内皮细胞上的mRNA表达。用免疫荧光，流式细胞仪分析TLR4蛋白在细胞上的定位。用免疫荧光，荧光素酶报道基因和Westerrl blot分析LPS对TLR4信号的激活，用RT-PCR分析TLR4激活以后促炎性细胞因子TNF-α和诱导型一氧化氮合成酶 (inducible nitric oxidesynthase，iNOS) 的mRNA表达。用TLR4抗体阻断技术和NF-κB的抑制剂Aspirin分析LPS刺激TLR4介导的信号通路。 【结果】 (1)根据文献报道的方法，我们从大鼠肺组织中分离培养得到微血管内皮细胞，这些细胞为铺路石形，可以连续传2—5代，并表现为Ⅷ因子阳性。 (2)各种Toll受体mRNA在正常未受干预微血管内皮细胞上表达程度不同，TLR5和TLR9无表达，而TLR4表达最高(P<0.01)。 (3)免疫荧光显示TLR4在大鼠肺微血管内皮细胞膜上呈阳性，少量分布在细胞质中，流式细胞仪表明95％的细胞显示细胞膜上很强的TLR4分布。 (4)用LPS刺激1、3、6小时后JNK、p38表达均增加(P<0.01)，还引起IκB-α降解(P<0.01)，导致NF-κB的亚基p65入细胞核。 (5)LPS可以明显增加TNF-α和iNOS的mRNA的表达(P<0.01)，呈现时间反应，在L2S刺激72小时后TNF-α和iNOS的表达达到高峰。 (6)培养基中使用TLR4的抗体和Aspirin可以几乎完全阻断LPS引起的IκB-α降解、p65入核以及TNF-α和iNOS mRNA表达的增加。 【结论】 (1)TLR4在大鼠肺微血管内皮细胞上的确呈高表达，并且绝大多数分布在细胞膜上。 (2)在大鼠肺微血管内皮细胞上LPS能够激活TLR4下游多个信号转导分子JNK、p38和NF-κB，启动炎性反应。 (3)应用TLR4抗体和NF-κB抑制剂Aspirin能够几乎完全阻断L2S刺激引起的炎性细胞因子TNF-α和iNOS的表达增加，高度提示了在大鼠肺微血管内皮细胞上LPS是主要通过TLR4介导激活NF-κB而完成信号转导，导致内皮细胞活化，使内皮参与活跃的免疫反应，在GNB致病过程中进一步利用工具药说明了以往的报道及理论的正确性。 第二部分 辛伐他汀对TLR4受体的表达和其下游信号转导过程的影响 【目的】研究辛伐他汀对TLR4所介导的信号的抑制作用，探讨辛伐他汀成为临床上潜在的抗炎药的可能性 【方法】体外培养大鼠肺微血管内皮细胞，用Western blot分析辛伐他汀处理大鼠肺微血管内皮细胞后TLR4蛋白质表达。用免疫荧光，荧光素酶报道基因和Wes-terrlblot分析辛伐他汀对L2S—TLR4信号通路的抑制作用。分别用RT-PCR和ELSIA分析辛伐他汀对LPS诱导的促炎性细胞因子TNF-α和iNOS的mRNA和蛋白质表达的影响。 【结果】 (1)辛伐他汀处理大鼠肺微血管内皮细胞引起TLR4的蛋白质表达下调，并且作用表现为时间依赖性(P<0.01)，在72小时最明显。 (2)辛伐他汀抑制了TLR4激活以后的IκB-α的降解，p65的入核和NF-κB的转录活性(P<0.01)并且这种作用出现在TLR4蛋白质表达下调之前。 (3)辛伐他汀抑制LPS对促炎性细胞因子TNFα和iNOS的mRNA和蛋白质表达的诱导，呈剂量效应正相关(P<0.05)。 【结论】辛伐他汀能够抑制TLR4的表达和干扰其介导的信号通路。因此辛伐他汀作为一种潜在的有临床应用前途的抗炎药，有可能用于治疗TLR4相关的炎症性疾病，为临床上防治肺部炎症反应ALI/ARDS等提供新思路。

目录

声明

前言

第一部分LPS诱导的TLR4在肺微血管内皮细胞上的信号转导

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分辛伐他汀对TLR4受体的表达和其下游信号转导过程的影响

材料和方法

结果

讨论

小结

总结

参考文献

致谢

综述一：TOLL样受体在ARDS发病机制中的研究进展

综述二：他汀类药物(辛伐他汀)的抗炎作用

附录