谷氨酸NMDA受体拮抗剂MK801对边缘叶癫痫发作大鼠多药转运体表达的影响

摘要

癫痫是神经系统常见的临床综合征，慢性、突发性和反复刻板发作为其主要临床特点。尽管新抗癫痫药(antiepileptic drugs，AEDs)不断问世，但仍有30％患者的发作不能控制，成为难治性癫痫。这部分患者多为复杂部分性发作(多见于成人)和各种癫痫综合征(多为儿童)，不仅对常规AEDs的反应较差(具有耐药性)，即使是新型AEDs对这部分癫痫患者的疗效也不十分肯定。大量研究表明由于癫痫源性脑组织的血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)上具有药物外排作用的多药转运体(multidrug transporters，MDTs)的过度表达，限制了脑组织对AEDs的摄取，影响了药物到达作用靶点而形成耐药。癫痫发作可引起MDTs的过度表达，癫痫发作又引起谷氨酸释放增加，谷氨酸通过活化NMDA受体上调大鼠脑微血管内皮细胞P-gp的表达，提示癫痫发作后MDTs的过度表达可能与NMDA 受体的活化有关，我们首先观察边缘叶癫痫发作大鼠模型癫痫持续状态(status epilepticus，SE)后72 h内海马MDTs的表达变化；然后分别在SE后MDTs mRNA 和蛋白表达最高时点观察NMDA受体拮抗剂MK801对MDTs表达的影响；最后在细胞水平观察谷氨酸刺激对大鼠脑微血管内皮细胞(rat brainmicrovessel endothelial cells.RBMECs)mrp2 mRNA表达和外排功能的影响，以及MK801预处理后对谷氨酸作用的影响。 第一部分：多药转运体在边缘叶癫痫发作后的动态表达变化。 目的： 探讨SE终止后72 h内P-gP、Mrp2、Bcrp表达的时间规律，明确MDTs表达的细胞类型分布。 材料与方法： 制备氯化锂一匹罗卡品癫痫发作大鼠模型，用实时荧光定量RT-PCR法检测SE终止后0 h、3 h、6 h、24 h、72 h和control组海马组织P-gp、Mrp2、Bcrp、Ralbpl、Pxr的mRNA表达；Westem blot检测SE终止后3 h、6 h、24 h、72 h和control组海马组织P-gP、Mrp2、Bcrp的蛋白表达；免疫荧光检测SE终止后24 h和对照组P-gP、Mrp2,Bcrp分别与vWF、MAP2、GFAP 双标染色，以上各组每组6只大鼠。 结论：癫痫发作诱导P-gp、Mrp2、Bcrp暂时性过度表达，癫痫发作可诱导神经元和星形胶质细胞表达以上3种MDTs。 第二部分：谷氨酸NMDA受体拮抗剂MKS01对癫痫发作后多药转运体P-gp、Mrp2、Bcrp表达的影响。 目的： 观察NMDA受体对边缘叶癫痫大鼠发作后P-gp、Mrp2、Bcrp表达的影响，探讨NMDA受体是否能对癫痫发作后上述3种MDTs的表达进行调控。 材料与方法： 动物共分为3组：control、MK801和SE组，SE组即氯化锂—匹罗卡品癫痫发作大鼠模型组，MK801组即SE组加MK801(0.5 mg/kg)预处理组，control组即除匹罗卡品改用生理盐水代替外，其他给药同SE组。使用实时荧光定量RT-PCR 和 Westem blot分别检测P-gp、Mrp2、Bcrp mRNA(SE终止后6 h)和蛋白(SE终止后24h)表达，使用免疫组化检测SE终止后24 h时上述3种MDTs 的表达分布。 结论： NMDA受体拮抗剂MK801能逆转癫痫发作后P-gp、Mrp2、Bcrp的过度表达，NMDA受体的活化参与介导癫痫发作后P-gp、Mrp2、Bcrp的过度表达。在边缘脑区和大脑皮层中，SE组上述3种MDTs表达较control组明显增加，大多：MK801组明显低于SE组，并与control组表达水平相当。 第三部分：谷氨酸、NMDA受体拮抗剂MK801对大鼠脑微血管内皮细胞mrp2mRNA表达和外排功能的影响。 目的： 观察谷氨酸对RBMECs上mrp2 mRNA表达和外排转运功能的影响，探讨NMDA受体是否影响谷氨酸刺激RBMECs后mrp2 mRNA和外排转运功能的变化。 材料与方法： 分离2周龄SD大鼠的大脑皮层微血管段，并进行原代RBMECs培养。待RBMECs生长至融合后，进行以下实验。MTT法检测不同浓度谷氨酸刺激对RBMECs活力的影响，细胞分组：control组，不给任何特殊处理；Glu组，给100μM谷氨酸刺激30 min后吸去上清，再培养24 h；MK801组，加入谷氨酸前，用100μM K801预处理15 min，其他处理同Glu组。实时荧光定量RT-PCR检测mrp2 mRNA的表达。底物外排实验检测不同干预对RBMECs上Mrp2外排转运功能的影响。 结论： 谷氨酸刺激RBMECSs可诱导mrp2 mRNA表达和外排转运功能的增强，NMDA受体的拮抗剂可完全逆转谷氨酸的这一作用。 本文结论: 1、癫痫发作诱导P-gp、Mrp2、Berp暂时性过度表达，癫痫发作可诱导神经元和星形胶质细胞表达以上3种MDTs。 2、NMDA受体拮抗剂MK801能逆转癫痫发作后P-gP、Mrp2、Bcrp的过度表达，NMDA 受体的活化参与介导癫痫发作后P-gP、Mrp2、Bcrp的过度表达。 3、谷氨酸刺激RBMECSs可诱导mrp2 mRNA表达和外排转运功能的增强，并且NMDA受体的拮抗剂MK801可以逆转谷氨酸的这一作用。

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摘要

前 言

第一部分多药转运体P-gp、Mrp2、Bcrp在边缘叶癫痫发作后的动态表达变化

材料

结果

一、癫痫发作的行为学观察

二、癫痫大鼠的脑电图观察

三、透射电镜

四、癫痫发作大鼠海马P-gp、mrp2、bcrp、ralbp1、pxr mrna的表达变化

四、癫痫发作大鼠海马P-gp、Mrp2、Bcrp蛋白水平的表达变化

五、癫痫发作大鼠海马P-gp、Mrp2、Bcrp蛋白在海马组织内的细胞分布

讨论

小结

参考文献

第二部分谷氨酸NMDA受体拮抗剂MK801对多药转运体P-gp、Mrp2、Bcrp表达的影响

材料和方法

结果

一、电脑图评价MK801对癫痫发作模型电发放的影响

二、MK801对癫痫发作大鼠海马P-gp、mrp2、bcrp mRNA表达变化的影响

三、MK801对癫痫发作大鼠海马P-gp、Mrp2、Bcrp蛋白表达变化的影响

四、MK801对癫痫发作大鼠皮层及边缘系统脑区P-gp、Mrp2、Bcrp蛋白表达和分布变化的影响

五、HE染色观罕海马细胞排列和形态学变化

讨论

小结

参考文献

第三部分谷氨酸NMDA受体拮抗剂MK801对大鼠脑微血管内皮细胞Mrp2mRNA表达和外排功能的影响

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文小结

本研究的创新之处

本研究的不足之处

综述 难治性癫痫多药转运体耐药机制的研究进展

致谢

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