银杏中Gbhdr基因的克隆和银杏遗传转化的研究

摘要

银杏内酯是在银杏提取物已确定的药用功能中起着主要作用的有效药用成分。由于不断扩大的银杏制品的市场需求和有限的银杏树资源，用基因工程修饰生物合成途径成为了银杏内酯代谢工程中最具潜力的方法。 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶是质体MEP途径末端的酶，为银杏内酯的生物合成提供了异戊烯前体。用RACE方法首次从银杏中分离得到编码HDR蛋白的全长cDNA，称为GbHDR(Genbank登录号：DQ364231)。GbHDR含有一个1422bp的开放阅读框，编码474个氨基酸。推测的GbHDR蛋白序列与其他植物物种有较高的同源性，具有四个保守的半胱氨酸残基，并且预测其N端有一个叶绿体转运肽。二级结构预测显示GbHDR与拟南芥中的HDR蛋白具有相似的二级结构。Southern blot分析表明GbHDR是一个单拷贝基因。组织表达分析显示GbHDR在根中表达最高，而在叶和茎中表达量相对较低。GbHDR基因的克隆和分析为我们进一步进行银杏内酯代谢工程提供了一个重要的靶点基因。 为建立银杏遗传转化的高效体系，对一些重要的影响银杏转化的因素，包括外植体类型，选择标记和筛选压，农杆菌工程菌株，共培养时间和恢复时间第一次进行了试验并优化了条件。PCR分析和GUS活性的组织化学检测被用来验证独立的潮霉素抗性愈伤的成功转化和报告基因的表达。在以下条件下得到了最高的转化率(43.8％)：银杏种子胚用农杆菌EHAl05转化后共培养3天。经过28天恢复期，从转化过的胚诱导出的愈伤用添加了10mg/L潮霉素的培养基进行筛选培养。大约1个月后，从褐化死亡的愈伤组织上冒出的小白点即潮霉素抗性愈伤被取下培养至一定量可以进行后续分析。 为了研究银杏内酯生物合成途径中的酶对银杏愈伤中银杏内酯含量的影响，我们基于pCAMBIAl304载体同时构建了单基因和双基因表达载体，由CamV35S启动子启动基因，包括载体1：p1304+Gbhdr；载体2：p1304+Gblps；载体3：p1304<'+>+Gbggpps；载体4：p1304<'+>+Gblps+Gbggpps．把这些载体按照上述的最佳方案转化银杏。至今得到了p1304<'+>+Gbggpps和p1304+Gblps的转基因愈伤组织，并用PCR检测进行了确认。半定量RT-PCR显示出Gbggpps在不同的转基因愈伤组织中有不同水平的表达总的来说，我们克隆并分析了银杏内酯生物合成途径中的一个重要基因——GbHDR，并且建立了一个高效的遗传转化体系以从银杏种子胚得到转基因愈伤组织。另外，为进行初步的银杏内酯代谢工程研究，构建了带有一个或两个合成酶基因的植物表达载体。以上工作不仅对于更全面地了解银杏内酯生物合成途径中的酶很有帮助，同时也为进一步进行银杏内酯代谢工程奠定了基础。

目录

论文说明：缩写词表

声明

论文摘要

第一章 文献综述

1.1银杏内酯的结构和作用

1.1.1银杏内酯的结构

1.1.2银杏内酯的药理作用

1.2银杏内酯的制备方法

1.2.1天然提取法

1.2.2化学合成法

1.2.3细胞培养法

1.3提高银杏组织培养物中银杏内酯含量的研究进展

1.3.1优化培养条件

1.3.2加入前体物质

1.3.3化学或生物诱导子

1.4银杏内酯生物合成途径中的合成酶基因的研究进展

1.4.1银杏内酯生物合成的上游途径

1.4.2银杏内酯生物合成的下游途径

1.5银杏的遗传转化和银杏内酯的代谢工程

第二章 银杏内酯生物合成途径中重要基因Gbhdr的克隆与研究

2.1实验材料

2.1.1植物材料及处理

2.1.2菌株和载体

2.1.3培养基和抗生素

2.1.4试剂盒，酶及分子量标准

2.1.5引物

2.1.6仪器和设备

2.2实验方法

2.2.1银杏RNA的抽提

2.2.2银杏Gbhdr基因核心片段的获得

2.2.3 3'RACE获得3’端目的基因

2.2.4 5'RACE获得5’端目的基因

2.2.5 Gbhdr基因全长cDNA和基因组全长的克隆

2.2.6 Gbhdr基因的生物信息学分析

2.2.7 Gbhdr基因组DNA的克隆

2.2.8 Southern blot分析

2.2.9半定量RT-PCR分析

2.3结果与讨论

2.3.1 Gbhdr全长 cDNA序列及分析

2.3.2 GbHDR同源性分析

2.3.3 GbHDR二级结构预测

2.3.4 GbHDR系统进化树分析

2.3.5 Gbhdr基因组序列及其Southern blot分析

2.3.6 Gbhdr在不同组织中的表达情况

2.3.7 讨论

第三章 银杏高效转化体系的建立

3.1材料与方法

3.1.1植物材料

3.1.2农杆菌工程菌株

3.1.3植物表达载体

3.1.4设备与仪器

3.1.5银杏转化中所用到的培养基

3.1.6银杏转化预实验

3.1.7农杆菌介导的银杏遗传转化体系建立

3.1.8抗性愈伤的筛选和扩大培养

3.1.9抗性愈伤的PCR检测

3.1.10抗性愈伤的GUS染色

3.2结果与讨论

3.2.1外植体的选择

3.2.2筛选标记的选择和筛选压的确定

3.2.3农杆菌工程菌株选择

3.2.4最佳共培养时间的选择

3.2.5恢复培养时间的确定

3.2.6抗性愈伤的筛选和扩大培养

3.2.7抗性愈伤的PCR检测

3.2.8抗性愈伤的GUS活性检测

3.2.9讨论

第四章 植物表达载体的构建与目的基因的转化

4.1材料与方法

4.1.1植物材料

4.1.2银杏RNA的提取

4.1.3银杏cDNA第一链的合成

4.1.4银杏lps，ggpps，hdr基因编码区的克隆

4.1.5植物表达载体pCAMBIA1304+Gblps的构建

4.1.6植物表达载体pCAMBIA1304+Gbhdr的构建

4.1.7植物表达载体pCAMBIA1304++lps+ggpps的构建

4.1.8农杆菌EHA105的转化

4.1.9根癌农杆菌EHA105介导转化银杏胚

4.1.10银杏愈伤组织DNA的提取

4.1.11银杏愈伤组织RNA的提取

4.1.12 PCR检测目的基因

4.1.13 半定量RT-PCR检测目的基因的表达

4.2结果与讨论

4.2.1带相应粘性末端酶切位点的目的基因编码区的扩增

4.2.2单基因植物高效表达载体p1304+Gblps和p1304+Gbhdr的构建

4.2.3双基因植物高效表达载体p1304++Gbggpps+Gblps的构建

4.2.4农杆菌介导p1304++Gbggpps和p1304++Gblps遗传转化银杏幼胚

4.2.5抗性愈伤组织的PCR检测

4.2.6 RT-PCR检测目的基因的转录

4.2.7讨论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

致 谢