海藻糖对未转染和已转染人野生型或A53T突变型α突触核蛋白基因的PC12细胞的促自噬作用研究

摘要

帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是常见的神经退行性疾病,但迄今该病病因和发病机制未明。路易小体(Lewybody)是PD患者脑内特征性的病理学标志,异常聚集的α突触核蛋白(α-synuclein)是家族遗传性和散发性PD患者脑内路易小体的主要成份。α突触核蛋白的病理性积聚是PD临床症状发生、发展及受累脑区变性的重要原因。如何阻断α-synuclein的异常沉积或者促进聚集的α-synuclein降解是当前PD研究中的重要课题。近年来,相关研究发现海藻糖通过与蛋白质分子间的相互作用,可抑制中枢神经系统变性病中相关蛋白的异常聚集。海藻糖还可促进强力霉素诱导的转染人A53T突变型α-synuclein基因的PC12细胞自噬,并且能促使突变的α-synuclein降解。我们利用慢病毒表达载体,建立长期稳定过表达人野生型和A53T突变型α-synuclein的PC12细胞株,利用蛋白酶体抑制剂(MG132)抑制α-synuclein降解,建立α-synuclein异常聚集的PD细胞模型,观察海藻糖是否对未转染的PC12细胞、过表达人野生型和A53T突变型α-synuclein的PC12细胞有相似的促自噬作用,并且能否使异常聚集的野生型和A53T突变型α-synuclein降解;另外,自噬的增强对细胞的存活是否有影响。
　　第一部分 人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白慢病毒表达载体的构建及在PC12细胞中的转染
　　目的：构建长期稳定过表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白的PC12细胞株。
　　材料和方法：首先制备慢病毒表达载体,经测序鉴定正确后转染PC12细胞,然后通过细胞的免疫荧光染色检测α-synuclein-V5融合蛋白,PCR法扩增转基因PC12细胞的SNCA片段后进行测序检测突变基因,WesternBlot法检测PC12细胞α-synuclein的表达从而鉴定转基因细胞能否稳定表达目的基因,MTT法测细胞活力,绘制生长曲线。
　　结果：经测序,pLenti6/V5-SNCA-WT和pLenti6/V5-SNCA-A53T表达质粒构建成功;免疫荧光染色示基因转染后,大于95％的PC12细胞中有α-synuclein-V5融合蛋白表达;转基因细胞的SNCA片段测序结果显示,慢病毒表达载体成功整合入PC12细胞基因组;WesternBlot法检测结果示转基因PC12细胞能够过表达α-synuclein蛋白。3种细胞生长曲线无明显差异。
　　结论：我们已成功构建了人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白慢病毒表达载体,并且成功建立了稳定过表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白的PC12细胞株,过表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白对细胞活力无明显影响。
　　第二部分海藻糖促进未转染和已转染人野生型或A53T突变型α突触核蛋白基因的PC12细胞自噬
　　目的：研究海藻糖对未转染和已转染人野生型或A53T突变型α-synuclein基因的PC12细胞的促自噬作用。
　　材料和方法：用不同浓度(10mM、50mM和100mM)的海藻糖干预细胞24h,然后用免疫荧光检测自噬泡及自噬溶酶体,用透射电镜观察细胞内自噬泡数量的变化,用免疫印迹检测LC3II和α-synuclein的表达,观察海藻糖对细胞是否有促自噬作用,能否促进过表达的人野生型和A53T突变型α-synuclein降解;用MTT法检测细胞活力,观察海藻糖对细胞有无损伤或保护作用。
　　结果：50mM和100mM的海藻糖能使细胞内自噬泡和自噬溶酶体显著增多,并且使LC3II的表达量显著上调(P<0.01),同时促进A53T突变型α-synuclein的降解(50mM海藻糖组,P<0.05;100mM海藻糖组,P<0.01),而对WT型α-synuclein无明显影响(P>0.05);给予2mM3-MA预孵育3小时可以阻断海藻糖的促自噬作用;50mM和100mM海藻糖均能降低PC12细胞和A53T转基因细胞的活力(P<0.01),仅100mM海藻糖能降低WT转基因细胞活力(P<0.05)。海藻糖对WT转基因细胞的损伤作用较其他两种细胞弱(P<0.05)。
　　结论：海藻糖能促进未转染和已转染人野生型或A53T突变型α-synuclein基因的PC12细胞自噬,并且能促进A53T突变型α-synuclein降解,但对野生型α-synuclein无明显作用。大剂量海藻糖能降低细胞活力,对WT转基因细胞的活力影响较轻。

目录

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 人野生型和A53T突变型α突触核蛋白慢病毒表达载体的构建及在PC12细胞中的转染

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 海藻糖促进未转染和已转染人野生型或A53T突变型α突触核蛋白基因的PC12细胞自噬

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 海藻糖对蛋白酶体抑制剂介导的PD细胞模型的作用

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文小结

综述

致谢

博士期间发表论文