用于改善生物大分子药物功效的超多孔水凝胶、纳米粒新型给药载体

摘要

随着科学技术的迅猛发展,以往单一学科及其技术难以解决的关键科学问题经多学科交叉及技术的使用获得突破。本文运用生物科学、材料科学、纳米科学及药剂学等学科的理论和方法,研究可显著改善蛋白质多肽类药物及DNA、siRNA功效的新型给药载体及其作用机理。
　　蛋白质多肽、核酸等生物大分子药物药理活性强、特异性高,在肿瘤、糖尿病、感染性疾病等重大疾病的治疗中显示出巨大潜力,但其临床应用主要为注射剂型,多数药物半衰期短,长期用药患者顺应性差。而非注射给药特别是口服给药时,此类亲水性生物大分子药物不易被亲脂性的生物膜摄取,易被体内各种酶降解导致活性降低或失活,生物利用度低。利用给药系统(DrugDeliverySystem,DDS)可提高生物大分子药物的体内外稳定性、促进药物吸收、改善药物体内作用功效。其中水凝胶给药载体还可控制药物释放,具有生物黏附、生物相容和生物可降解等特性;纳米给药载体还可增溶难溶性药物,缓控释药物和靶向给药。
　　同时具有抑制蛋白酶活性、促进药物渗透及黏膜黏附等性质的多功能聚合物给药载体可显著提高蛋白质多肽类药物的口服吸收,能有效突破胞外屏障(吞噬系统、核酸酶)和胞内屏障(细胞膜、内涵体、溶酶体、核膜)的多功能非病毒基因载体有望持续、高效地将基因导入靶细胞和靶组织。据此,设计并研究新型互穿网络聚合物超多孔水凝胶(SPH-IPN),以胰岛素为模型药物,研究SPH-IPN促进蛋白质多肽类药物的口服吸收及作用机理:依据壳聚糖季胺盐(TMC)与巯基化聚合物黏膜黏附及促渗特点,设计一种新型壳聚糖多功能衍生物-巯基化壳聚糖季胺盐(TMC-Cys),以胰岛素和pEGFP分别作为模型蛋白质药物和模型基因,研究其自组装纳米载体促进蛋白质药物口服吸收、基因转染及其作用机理:对TMC-Cys纳米载体进行甘露糖配体修饰,以TNF-αsiRNA为靶基因,研究甘露糖修饰的TMC-Cys(MTC)纳米载体对小肠M细胞、巨噬细胞的主动靶向作用及增加siRNA口服给药功效与作用机理。
　　1.SPH-IPN的制备和表征
　　以丙烯酸(AA)和丙烯酰胺(AM)为单体,过硫酸铵(APS)/N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)为引发体系,NaHCO3为起泡剂,N,N’-亚甲基-双丙烯酰胺(Bis)为交联剂,溶液聚合制得聚(丙烯酸-丙烯酰胺)(P(AA-co-AM))超多孔水凝胶;采用分步互穿网络聚合物技术,聚合时加入O-羧甲基壳聚糖(O-CMC),胶凝后以戊二醛(GA)交联O-CMC;制得SPH-IPN。傅立叶变换红外光谱(FTIR)、核磁共振(13CNMR)、差示扫描量热分析(DSC)等研究表明SPH-IPN中含有P(AA-co-AM)和交联的O-CMC;扫描电镜(SEM)、光镜、共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察表明SPH-IPN含有大量相互连接、直径100-300μm的孔隙,O-CMC围绕孔隙边缘分布。SPH-IPN孔隙率大于80％,水中可快速溶胀,平衡溶胀比30-80,SPH-IPN的溶胀比随O-CMC含量增加、交联度增加、交联时间延长而降低。引入互穿网络聚合物(IPN)结构可显著提高SPH-IPN的压缩模量和拉伸模量;压缩模量和拉伸模量均随O-CMC含量增加而显著提高:压缩模量随O-CMC交联度增加、交联时间延长而显著提高。
　　2.SPH-IPN的刺激敏感性溶胀及载药和释药特性
　　考察pH、离子强度和温度对SPH-IPN溶胀行为的影响;以胰岛素为模型药物,研究SPH-IPN的载药量、载胰岛素SPH-IPN在不同介质中的体外释放行为、载药前后胰岛素的稳定性及聚合物-药物相互作用;研究SPH-IPN中水的状态及保水性。
　　研究表明,SPH-IPN的溶胀具有离子强度、pH和温度敏感性。离子强度≥0.0lmol·L-1时,SPH-IPN的溶胀比随离子强度增大而减小;离子强度≤0.001mol·L-1时,溶胀不受影响。pH≤3.0时SPI-IPN几乎不溶胀;3.0≤pH≤6.2时随pH升高溶胀速率加快,溶胀比增大;pH≥6.2时溶胀充分,溶胀行为无显著改变;SPH-IPN对脉冲式pH改变可快速响应,呈现可逆的溶胀-去溶胀行为。温度升高可促进SPH-IPN的溶胀。SPH-IPN对胰岛素吸附载药的载药量为4％-7％,显著高于传统超多孔水凝胶(CSPH);载药量随O-CMC含量增加而略有降低。胰岛素体外释放对离子强度、pH和温度敏感。圆二色谱分析和生物活性检测结果表明载药前后胰岛素的构象和生物活性无显著变化。SPH-IPN对胰岛素的实际载药率显著高于理论载药率,pH7.4PBS介质中药物可快速、完全释放,空白SPH-IPN和释药后SPH-IPN的FTIR图谱相似,表明SPH-IPN与胰岛素间存在较强的物理相互作用,不存在化学共价连接。溶胀的SPH-IPN中可冻结水占主要部分;SPH-IPN与水分子形成氢键的作用随O-CMC含量和胰岛素载药量增加而减弱。外加压力与37℃孵育时,SPH-IPN保水性较好,保水性随O-CMC含量增加而提高。
　　3.SPH-IPN增加胰岛素口服吸收及促吸收机理
　　考察载胰岛素SPH-IPN正常大鼠口服给药和回肠给药的生物利用度,以及糖尿病模型大鼠口服给药降血糖效果;从黏膜黏附、蛋白酶抑制、渗透促进、小肠滞留等方面探讨SPH-IPN促胰岛素肠道吸收机理;考察聚合物结构完整性对SPH-IPN抑酶、促渗、小肠滞留及胰岛素口服吸收的影响。
　　正常大鼠口服载胰岛素完整的SPH-IPN(I-SPH-IPN)后药物吸收和降血糖效果显著,血糖最低降至初始值的65％,相对皮下注射的口服生物利用度为5.0％,药理生物利用度为6.3％;口服载胰岛素粉碎的SPH-IPN(P-SPH-IPN)后药物吸收和降血糖效果均不明显;回肠给予载胰岛素I-SPH-IPN和P-SPH-IPN时,药物吸收和降血糖效果显著,血糖最低降至初始值的30％,二者效果相当,均优于口服给药;糖尿病模型大鼠口服载胰岛素I-SPH-IPN后降血糖效果显著。SPH-IPN可通过非特异性作用和机械作用黏附至小肠黏膜,黏附力随O-CMC含量增加而增大。SPH-IPN可通过捕获蛋白酶溶液和络合Ca2+抑制肠腔蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶)活性,且SPH-IPN络合二价金属离子的能力随O-CMC含量增加而增强,抑酶作用相应增强。I-SPH-IPN和P-SPH-IPN的体外抑酶作用相当,I-SPH-IPN可减少药物在肠腔中的释放,增加黏液层和黏膜中的释放,从而降低肠腔蛋白酶对药物的降解,I-SPH-IPN对胰岛素的保护作用强于P-SPH-IPN。SPH-IPN通过机械作用可逆打开小肠上皮细胞间紧密连接,促进胰岛素的胞间转运;加入I-SPH-IPN和P-SPH-IPN,Caco-2细胞单层的跨膜电阻最低分别降至初始值的25％和50％,FITC-胰岛素在Caco-2细胞单层中的转运量分别提高至未加聚合物的4.9和1.9倍,离体小肠中的Papp分别提高至4.2和1.8倍,表明I-SPH-IPN打开上皮细胞间紧密连接和促胰岛素渗透的能力强于P-SPH-IPN。I-SPH-IPN通过机械作用固定于大鼠小肠壁,小肠滞留时间超过8h;P-SPH-IPN在小肠中易分散,无法通过机械作用固定于肠壁,滞留时间短于4h。
　　4.SPH-IPN的生物相容性
　　考察SPH-IPN的细胞毒性、基因(遗传)毒性、小肠组织相容性、口服急性、亚急性毒性和血液相容性,从整体动物、组织、细胞和分子水平评价SPH-IPN的安全性;HPLC测定SPH-IPN中单体和交联剂的残留量,为生物相容性评价提供依据。
　　FDA／PI双染色、LDH、中性红、蛋白质含量测定试验结果表明RBL-2H3和Caco-2细胞与SPH-IPN及其浸提液(1O、1、0.1mg·mL-1)短时程(24h)接触后,胞外LDH释放量、胞内中性红摄入量、蛋白质含量均无显著变化,细胞活力无显著影响;MTT试验结果表明二种细胞与SPH-IPN及其浸提液长时程(7d)接触后,细胞增殖率无显著影响,SPH-IPN细胞毒性低。DNALadder、流式细胞仪检测、单细胞凝胶电泳和小鼠骨髓微核试验结果表明SPH-IPN不会引起RBL-2H3和Caco-2细胞凋亡、DNA断裂和小鼠骨髓微核发生,基因毒性低。SPH-IPN不会引起大鼠小肠黏膜组织损伤,组织相容性良好。SPH-IPN浸提液小鼠灌胃给药最大耐受剂量为1000mg·kg-1；亚急性毒性试验中连续28天每天一次灌胃给予SPH-IPN浸提液(500、200、100mg.kg-1),小鼠体重增长正常,血液学和血清生化指标正常,肝、肾、脾重量正常,组织切片中未见炎症、坏死、水肿等病理现象,肝、肾、脾中ACP、ALKP、GPT、GOT和LPO含量正常,表明SPH-IPN口服安全性好。SPH-IPN的溶血率低于5％,动态凝血率低于硅化玻璃,血小板黏附率低,具有一定的抗凝血效果,血液相容性良好。SPH-IPN中AA、AM和GA的残留量分别为1.4±0.6、2.0±0.2、<0.2ppm,符合其限量规定。
　　5.巯基化壳聚糖季胺盐自组装纳米粒增加胰岛素口服吸收及其作用机理
　　壳聚糖经季胺化和巯基化修饰制备TMC-Cys,表征理化性质;聚电解质(PEC)法制备TMC-Cys／胰岛素自组装纳米粒(TMC-CysNP)并表征理化性质;考察TMC-CysNP正常大鼠口服给药和回肠给药的降血糖效果,研究TMC-CysNP促胰岛素口服吸收机理。
　　壳聚糖(Mw30、200、500kDa)与碘甲烷反应合成季胺化度分别为15％和30％的TMC,TMC与Cys经EDAC／NHS催化的缩合反应合成FMC-Cys。400-500μmol·g-1Cys共价连接至TMC,其中约35％为游离巯基,其余为二硫键;游离巯基在中性条件下可氧化形成二硫键。FTIR和13CNMR表明TMC与Cys以酰胺键连接,DSC和TGA结果表明季胺化和巯基化修饰可改变壳聚糖的结晶度,降低其热稳定性。TMC-Cys的抑菌作用与TMC相近,清除自由基作用强于TMC,季胺化度较高时抑菌作用较强,清除自由基能力减弱。荷正电的TMC-Cys与荷负电的胰岛素经静电作用自组装形成TMC-CysNP,纳米粒呈球形,分散度良好,粒径为100-170nm,Zeta电势为+12-+18mV,胰岛素包封率达90％。纳米粒粒径、Zeta电势和包封率受胰岛素溶液pH、TMC-Cys／胰岛素质量比和离子强度影响;胰岛素体外释放受壳聚糖分子量、季胺化度、释放介质离子强度和离子类型影响。TMC-CysNP的小肠黏膜黏附力和黏蛋白黏附率较TMCNP分别提高2.1-4.7倍和1.5-2.2倍,黏蛋白黏附率随壳聚糖分子量或季胺化度升高而增加。DSC分析表明TMC-Cys通过与黏蛋白间形成二硫键提高黏附力。与TMCNP相比,TMC-CysNP胰岛素的离体小肠Papp提高1.7-2.6倍,Caco-2细胞摄取量提高1.7-3.0倍,Peyer’s结摄取量提高1.7-5.0倍,其中TMC-Cys(200,30)NP的促渗作用最强。大鼠口服和回肠给药时,TMC-CysNP的降血糖效果优于TMCNP,血糖最低分别降至初始值的65％和30％。Caco-2细胞MTT试验和大鼠回肠LDH试验结果表明TMC-CysNP细胞毒性低,安全性良好。
　　6.巯基化壳聚糖季胺盐纳米载体增加基因转染效率及其作用机理
　　以增强型绿荧光蛋白表达质粒(pEGFP)为模式质粒,PEC法制备TMC-Cys/pEGFP自组装纳米复合物(TMC-CysNC)并表征理化性质;考察TMC-CysNC在HEK293细胞和小鼠胫前肌中的体内外转染效率,研究其转染机制。
　　TMC-CysNC呈球形,分散度良好,粒径为150-400nm,Zeta电势为+14-+20mV;凝胶阻滞试验结果表明TMC-Cys可通过静电作用缩合pDNA;TMC-CysNC可有效保护pDNA免受核酶降解。TMC-CysNC的细胞黏附率较TMCNC显著提高;TMC-CysNC的HEK293细胞摄取率分别提高至TMCNC和Lipofectamine2000的1.4-3.0倍和1.6-4.4倍;4℃时TMC-CysNC的摄取量为37℃时的25％,叠氮钠和氯丙嗪处理分别使摄取量减少40％和70％,表明TMC-CysNC主要经能量依赖的网格蛋白介导的细胞内吞途径进胞;松胞素D和染料木素对TMC-CysNC的摄取无显著影响,表明进胞机理与细胞骨架的重构和窖蛋白介导的通路无关。TMC-CysNC的释放行为呈现谷胱甘肽(GSH)浓度依赖性,胞外GSH浓度下缓慢释放pEGFP,胞内GSH浓度下快速释放pEGFP并转运进核,细胞核中pEGFP的含量为TMCNC组的3.7倍。TMC-CysNC在HEK293细胞中的转染效率提高至TMCNC的1.4-3.2倍,其中TMC-Cys(100,30)NC的转染效率最高(约35％),为Lipofectamine2000的1.5倍。TMC-Cys(100.30)NC的体内转染效率分别提高至TMCNC和Lipofectamine2000的2.3倍和4.1倍。
　　7.靶向M细胞、巨噬细胞的MTC纳米载体增加siRNA口服给药功效及其作用机理
　　制备MTC及其纳米粒,研究纳米粒的理化性质;以TNF-αsiRNA为靶基因,研究MTC纳米粒对小肠M细胞、巨噬细胞的主动靶向作用和提高siRNA口服给药功效及其作用机理。
　　TMC(200、500kDa)经甘露糖修饰和巯基化修饰制得甘露糖修饰度约20％的MTC:捕获法、吸附法和自组装法分别制各载siRNAMTC纳米粒(en-MTC-TPPNP、ad-MTC-TPPNP和MTC-SANP),纳米粒为球形或亚球形,分散良好,粒径为130-230nm,Zeta电势为正值,siRNA包封率为70-80％,纳米粒可显著提高siRNA的血清稳定性:纳米粒粒径随壳聚糖分子量增大而增大;ad-MTC-TPPNP和MTC-SANP受离子强度影响较大,siRNA包封率随离子强度升高而显著降低,但en-MTC-TPPNP受离子强度影响较小。与载NCsiRNA的巯基化壳聚糖季胺盐纳米粒(en-TC-TPPNP)相比,en-MTC-TPPNP的Caco-2细胞和Raw264.7细胞黏附力显著提高,siRNA在Raw264.7细胞中的摄取量提高2.0-2.4倍,Peyer’S结摄取量提高1.9-2.4倍,体外M细胞模型和Caco-2细胞单层转运量提高1.2-2.1倍,离体小肠转运量提高6.9-11.0倍,且M细胞模型中的转运量显著高于Caco-2细胞单层中的转运量,含Peyer’s结离体小肠的转运量高于不含Peyer’s结离体小肠的转运量,表明甘露糖配体修饰载体可通过特异性配体-受体结合作用显著提高纳米粒对M细胞和巨噬细胞的主动靶向作用,从而促进siRNA的小肠摄取和转运。以TNF-αsiRNA为靶基因,en-MTC-TPPNP在Raw264.7细胞中的干扰效率显著强于en-TC-TPPNP和Lipofectamine2000;相同干扰效率(70％)时,en-MTC-TPPNP的siRNA剂量较Lipofectamine2000降低200倍。En-MTC-TPPNP在Raw264.7细胞和Caco-2细胞中基本无毒性,表明纳米粒在发挥基因沉默作用时不会造成细胞毒性。小鼠口服en-MTC-TPPNP可显著降低血清TNF-α含量。