超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记系统体内示踪内皮祖细胞移植对血管内皮损伤的修复作用

摘要

血管内皮损伤是动脉粥样硬化、血管再狭窄等心血管疾病的始动因素。其病理基础是血管内皮细胞损伤，内膜下基质暴露，血小板黏附聚集于该处，脱颗粒释放出有丝分裂原，后者在趋化血小板和粒细胞聚集的同时，又刺激中膜平滑肌细胞增殖、迁移、分泌以及血管壁结构的重塑。同时，血管内皮完整性的破坏也会导致其自身分泌的血管保护性介质(一氧化氮、前列环素等)的减少，血管收缩性介质及促生长物质的分泌增多。研究表明血管损伤后早期管腔内的再上皮化速度是决定修复后局部内膜增生程度的重要因素。如何加快损伤血管腔内面的上皮化从而有效修复内皮并抑制平滑肌增生已成为研究热点之一。
　　内皮祖细胞是一类来源于骨髓，动员后可进入外周血循环，定向归巢至损伤部位并进行分化的祖细胞群。大量研究己表明内皮祖细胞在血管新生和内膜修复中的重要作用。但在体外如何获取足量的内皮祖细胞，同时保证细胞的活性及生物学特征，避免其出现分化异常等仍是学者们需要解决的问题。另外了解内皮祖细胞体内的生物学分布、分化增殖等细胞的定位反馈情况可优化移植细胞的途径和细胞移植治疗的时间，从而指导临床的进一步治疗。
　　磁共振成像(MRI)具有特异性和敏感性高，空间分辨力强及临床安全等优势得以迅速发展，同时磁性物质标记细胞后并不会对细胞产生显著的生物学影响，且不需要放射性同位素(利于纵向长期研究)，因而广泛用于体内示踪干细胞的影像学检查。本研究利用磁性物质标记细胞，从而体外示踪移植细胞的生物学分布。首先我们体外分离培养出间充质干细胞，并在一定的条件下诱导其分化成为内皮祖细胞并扩增，随后通过超顺磁性氧化铁颗粒标记细胞，并将标记后的细胞移植入实验动脉颈动脉损伤模型，从而动态示踪细胞并评估内皮祖细胞在内皮修复过程中的作用。
　　第一部分骨髓源性内皮祖细胞的分离、培养和鉴定
　　目的：体外分离、培养、鉴定及扩增兔骨髓源性间充质干细胞诱导分化后的内皮祖细胞。方法：密度梯度离心法结合贴壁法从骨髓中分离培养间充质干细胞(MSCs)。以VEGF、bFGF定向诱导间充质干细胞分化为内皮祖细胞。对诱导后的细胞进行流式细胞、免疫荧光及免疫组织化学鉴定。结果：诱导后24h圆形细胞贴壁；72h细胞集落形成，呈纺锤形放射状生长：5d细胞呈漩涡状或条索状生长；7d内皮样细胞成片生长，互相连接并具有管腔样结构。流式细胞仪检测提示CD34、CD133双阳细胞占2.16±0.09％；免疫组化提示KDR阳性细胞占72.5±8.76％。激光共聚焦显微镜观察显示细胞Dil-ac-LDI，和FITC-UEA-1呈双染阳性。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法分离出的骨髓间充质干细胞，通过体外诱导分化可培养成为内皮祖细胞。
　　第二部分体外超顺磁性氧化铁纳米颗粒及绿色荧光蛋白病毒颗粒标记内皮祖细胞的生物学研究
　　目的：评估超顺磁性纳米铁颗粒及绿色荧光蛋白慢病毒颗粒标记对内皮祖细胞的毒性及细胞活力影响。方法：分别采用不同浓度的纳米铁颗粒转染和不同感染复数的慢病毒颗粒感染内皮祖细胞，评估细胞的MRI信号强度及细胞的活力试验、增殖试验、LDH释放试验、迁移试验及对细胞周期和凋亡试验。结果：随着纳米铁浓度的增加，T2WI MRI信号强度逐渐降低，在50ug/ml和100ug/ml难以分辨；细胞活力试验提示随着铁浓度的增加，细胞活力逐渐减低；LDH释放率逐渐增加，但<10％；对增殖能力、迁移能力及细胞周期和细胞凋亡均无影响。随着感染复数(MOI)的增加，细胞活力明显下降，MOI=50，细胞活力差异有统计学意义(P<0.05)，MOI=50，LDH释放率为10.34％，对细胞有一定毒性；MOI=25和50，细胞凋亡增加差异有统计学意义(P<0.05)，且迁移能力受到影响(P<0.05);不同MOI对增殖能力影响差异无统计学意义。结论：Fe2+浓度在25ug/ml，MOI=10的条件下，超顺磁性氧化铁颗粒对内皮祖细胞的生物学特性没有影响，可以作为磁标记。
　　第三部分体内磁共振成像示踪超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记的内皮祖细胞修复内膜损伤的实验研究
　　目的：评价MRI示踪SPIO标记的内皮祖细胞移植促损伤动脉内皮修复的作用。方法：将菲立磁和绿色荧光蛋白双标记的内皮祖细胞局部注入球囊损伤的颈动脉段腔内，术后1d、7d和28d行磁共振扫描、组织学检查及内皮型一氧化氮合成酶检测。结果：磁共振扫描发现移植部位出现低信号区。移植组HE、普鲁士蓝、vWF免疫组化染色、显微荧光均提示内皮祖细胞可粘附于内膜损伤处，并随时间分化为内皮细胞；同时内皮型一氧化氮合成酶表达随时间变化而增多。结论：菲立磁标记的内皮祖细胞可促进损伤动脉内皮的修复，并可为MRI示踪。