前列腺癌患者血清microRNA表达特点及miR-21在前列腺癌细胞中的功能研究

摘要

研究目的:
　　一、microRNA广泛表达于多种肿瘤组织内,血清microRNA的研究报道不多,在前列腺癌中更是罕有报道。本研究根据已有的microRNA差异表达谱筛选在前列腺癌中高表达的microRNA(主要有miR-20a,miR-21,miR-125b,miR-141),在前列腺癌患者血清中检测这些microRNA的表达情况,比较不同microRNA在前列腺癌的不同疾病阶段的表达情况及其与骨转移、预后和治疗有效性的相关性。
　　二、根据第一部分的研究结果,通过检测血清microRNA的表达情况,发现miR-21在激素抵抗性前列腺癌患血清者中的表达显著高于激素敏感性前列腺癌患者,而且miR-21随着血清PSA的升高而升高,提示miR-21可能对前列腺细胞的生长增殖有一定作用,而抑制细胞内miR-21表达有望抑制前列腺癌细胞的生长,甚至于逆转雄激素非依赖状态。为了探讨其中产生差异的机制,本课题进一步研究miR-21反义寡核苷酸对LNCaP前列腺癌细胞的生长的抑制作用及其内在分子机制。
　　材料和方法:
　　一、采用特异性TaqMan探针的实时定量PCR方法检测56例患者(包括局限性前列腺癌20例,激素敏感性骨转移前列腺癌20例,激素抵抗性骨转移前列腺癌10例,良性前列腺增生6例)血清中的miR-20a,miR-21,miR-125b,miR-141,U6snRNA作为内参。方差检验比较以上4类患者血清中miR-20a,miR-21,miR-125b,miR-141表达差异,探寻诊治方案选择及预后判断的新指标。
　　二、将特异性miR-21反义寡核苷酸,通过脂质体2000转染LNCaP前列腺癌细胞,观察前列腺癌细胞在转染后的增殖情况,绘制肿瘤细胞增殖曲线;转染48小时后分别提取肿瘤细胞胞浆和胞核内的蛋白,采用western-blotting方法分别检测胞浆、胞核内PTEN、mTOR、AKT、AR、PSA等蛋白的表达情况。比较转染特异性miR-21寡核苷酸对LNCaP前列腺癌细胞增殖的影响和肿瘤细胞内蛋白的影响。
　　结果:
　　一、miR-21在激素抵抗性骨转移前列腺癌患血清者中的表达显著高于激素敏感性骨转移前列腺癌患者,p=0.016。分层分析显示,激素敏感性前列腺癌患者中,PSA小于4ng/ml的患者的血清miR-21表达显著低于PSA大于4ng/ml的
　　患者;对多西他赛化疗抵抗的前列腺癌患者的血清miR-21表达明显高于对多西他赛化疗敏感的患者,p=0.032。而miR-20a和miR-125b在4组患者中未显示存在差异表达。miR-141在骨转移前列腺癌患者血清中的表达显著高于无骨转移的前列腺癌和良性前列腺增生患者,p=0.006;并且miR-141的表达水平与骨转移灶个数呈正相关性,p＜0.001。血清miR-21和miR141与前列腺癌Gleason评分呈正相关,G1eason评分＞7分的患者的血清microRNA表达水平显著高于Gleason评分＜=7分的患者,p值分别为0.001和＜0.001。
　　二、细胞生长曲线显示,在特异性miR-21反义寡核苷酸转染后,前列腺癌LNCaP细胞的增殖受到明显抑制。转染后,细胞核内的雄激素受体(AR)蛋白表达水平明显下调,细胞浆中无AR蛋白表达;胞浆内的前列腺特异抗原(PSA)蛋白的表达也明显下降,细胞核中无PSA蛋白的表达。此外,在转染后,细胞核内的AKT蛋白表达水平明显下调,而细胞浆中的AKT蛋白表达变化不明显;mTOR蛋白在细胞核内的表达也明显下降,但细胞核中的mTOR蛋白的表达反而升高。
　　结论:
　　在前列腺癌患者血清中检测microRNA是可行的,miR-21高表达于雄激素非依赖的骨转移前列腺癌患者,并对多西他赛化疗有效性具有预测价值;miR-141高表达于骨转移前列腺癌患者。miR-21可以作为雄激素非依赖前列腺癌的分子标记物,而miR-141可作为骨转移性前列腺癌的分子标记物。
　　抑制LNCaP前列腺癌细胞内的miR-21表达对细胞的增殖有明显抑制作用,其内在机制可能是miR-21有上调AKT表达的作用,进而使mTOR发生从胞浆到胞核的转运重分布;同时miR-21还可能具有上调AR的作用。而抑制细胞内的miR-21表达,胞核内的AR、mTOR和AKT蛋白的表达均下降,最终导致细胞增殖的抑制。因此,miR-21是一个潜在的基因治疗新靶点。