微生物生态学研究中通用引物的覆盖率评估以及高通量测序结果的自动化处理

摘要

微生物群落结构是微生物生态学研究的重要内容，分子生物学方法的应用使得对环境中未培养微生物的研究成为了可能，促使微生物生态学研究从基于培养的时代进入了分子生物学的时代。在分子生物学时代，我们面临的问题主要有两个，一个是如何无偏差的从环境样品中获得序列数据，另一个是如何快速、有效地从序列数据中提取有价值的信息。
　　序列数据的获得主要通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)进行，通过PCR技术可以直接从总的环境样品中选择性扩增特定的基因片段，从而对微生物群落结构进行分析。但是PCR过程中的很多因素都会导致有偏向性的PCR扩增，其中引物的偏向性会引起部分微生物类型的选择性扩增，导致该方法得到的微生物群落结构和真实情况出现偏差。全面理解各种通用引物的覆盖率对于正确阐释PCR结果具有重要作用。之前关于引物覆盖率的研究基本上都是定性或半定量的，所用数据多来自RDP等公共数据库，这些数据库中的序列很多是通过PCR方法得到的，数据结构已经受到PCR引物的影响。而且之前的研究也没有考虑引物和模板之间不同位置的错配对覆盖率的影响，尤其是引物3'端的4位碱基所发生的错配。
　　本研究对目前微生物生态学研究中面临的两个问题都进行了初步的研究。首先在RDP数据集和7个元基因组数据集的基础上对8个常用的细菌16S rRNA基因通用引物进行了非覆盖率的评估。在域的水平，每个引物在8个元基因组数据中的非覆盖率平均值都比相应引物在RDP数据中的非覆盖率值要高，除27F外，其它引物的该比值都在4以上，对于519R来说这个比值高达11.5。在门的水平，引物末4位碱基的单错配(single mismatch)对非覆盖率显示出重要影响，尤其是对338F和519F这两个引物，它们使338F在5个门以及519F在10个门中的非覆盖率提高了至少20％。对于每个引物，我们分析了引起其高非覆盖率的主要错配类型，以及这些错配类型在各个门中的分布，然后在这些错配类型的基础上通过引入简并碱基或门特异性的引物序列，对6个引物进行了改进，改进后的引物可以覆盖更广的细菌谱。
　　在序列数据的处理过程中，主要问题是缺少能够全面满足微生物生态学研究的系统化、自动化的软件。目前基于序列的微生物生态学研究主要分为两个阶段，一个是可操作分类单元(Operational Taxonomic Unit，简称OTU)的定义，可以大致提供样品的微生物多样性信息;另一个是序列的生物学分类，可以提供样品的微生物种类信息。一般的研究都包括这两个过程，但是现有的软件基本上都只能完成其中一个过程，满足我们的部分需求，而且大都限于16S rRNA基因序列的处理。随着高通量测序技术的发展以及测序费用的下降，单次研究所要处理的数据从几百条上升到了几万甚至几十万条，通过软件自动化的处理这些数据是广大微生物生态学家的共同需求。
　　为了解决数据处理过程中的难题，我们开发了软件OTU_Misess。OTU_ Misess是一个整合了序列的OTU定义和生物学分类的自动分析软件，除了分析细菌和古生菌的序列(16S rRNA)，还能分析真核生物(18S/ITS)和功能基因的序列，分析过程主要分为两个阶段:第一阶段是从峰图文件中读取碱基，经过序列质量和长度筛选之后去除载体和引物来源的序列片段，生成有效序列文件;第二阶段是对有效序列进行分析，包括OTU定义、微生物分类和末端限制性片段长度分析(Terminal Restriction Fragment，简称T-RF)。这两个过程可以一起进行，也可以分开进行。一次运行可以同时分析不同样品来源的数据，并且根据来源列出不同样品的群落组成。通过对已发表文章中的834条16S rRNA基因序列、181条18S rRNA基因序列以及975条ITS基因序列进行OTU_Misess分析，并和Greengenes以及RDP的分类结果进行比较，我们证明了OTU_Misess在16S rRNA、18S rRNA以及ITS基因序列分类功能上的可信度。
　　我们的工作对分子生物学方法在微生物生态学研究中的应用所面临的两个阶段的问题进行了初步研究，为了更深入的解决这些问题，使分子生物学方法能够更好地服务微生物生态学研究，我们将把引物评估的流程程序化、构建专门的处理元基因组数据的网站、优化OTU_Misess在数据处理方面的功能。

目录

摘要

第一部分 综述

1．1 微生物在环境中的存在情况

1．2 传统的微生物学研究方法

1．4 分子生物学方法在微生物生态学研究中的应用

1．4 基于PCR技术的分子生物学研究方法存在的问题

1．5 引物覆盖率评估及引物改进的必要性

1．6 元基因组学的发展对引物覆盖率评估的数据支持

1．7 高通量测序结果的分析过程

第二部分 研究内容

第一章 通用引物的覆盖率评估及引物的改进

2．1 研究背景

2．2 材料与方法

2．3 结果与讨论

2．4 结论

第二章 微生物生态学研究中高通量测序结果的自动化处理

3．1 研究背景

3．2 材料与方法

3．3 结果与讨论

3．4 结论

第三部分 展望

参考文献

致谢

附录 OTU_Misess结果说明

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