肝癌多光子光学诊断及肝移植术后索拉菲尼早期干预的实验研究

摘要

当前肝癌发病率我国居世界第一，癌症死因中肝癌在我国居第二，在全球居第三。尽管近半个世纪肝癌临床与基础研究有了不少进展，但肝癌总的预后仍差，诊疗水平仍有待于进一步提高。
　　 肝癌诊断，病理组织学诊断仍然是金标准。对于影像学及血清学诊断不清的病例，如甲胎蛋白阴性的占位性病变的诊断、肝良性结节与恶性结节的鉴别以及可疑肺转移结节的定性，都离不开病理活检。但传统病理活检，需要取材及随后的组织固定、包埋、切片、染色等步骤。同时，随着肝癌预后的不同，肝癌诊断目前已开始由单纯病理组织形态学诊断转向“病理-生物学”诊断的新阶段。诊断的核心，不仅仅是描述肝癌的特异性，而且是推断肝癌的生物学特性，即不仅仅回答肝癌的“是与否”，还需要判断肝癌的“好与坏”。传统的单纯病理组织形态学已不能满足上述需求。基于非线性光学和飞秒激光镭射之上的多光子光学诊断，通过利用活体组织中细胞本身产生的自体荧光及胶原组织产生的第二谐波，可以实时快速地获得组织及细胞的组织学特征，无需传统病理活检的组织切取、固定、包埋、切片、染色等步骤，是一种实时快速的诊断方法。细胞本身产生的自体荧光来自细胞内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。多光子光学诊断不仅可以捕获组织学特征，而且可以反映细胞代谢水平，其优点是实时、快速、便捷，同时又实现“形态”与“功能”的统一。由于目前尚无肝癌的多光子光学诊断的研究，因此本课题对此进行了探索。
　　 肝癌治疗，目前仍是以手术为主的综合治疗。手术，包括肝切除及肝移植，是肝癌患者获得长期生存的最重要手段。在我国，85％的肝细胞癌伴有乙型肝炎肝硬化。肝移植，对于肝硬化基础上的肝癌，既切除了肿瘤，又去除了肝硬化，一举两得。然而，移植术后易复发及转移，这是影响疗效及导致患者死亡的主要原因。既往的研究表明化疗、放疗、介入栓塞治疗等均无法抑制肝移植术后肿瘤复发及转移。因此，如何减少肝移植术后复发及转移，是当前研究的热点及难点。索拉菲尼，作为一种多激酶抑制剂，可以抑制RAF激酶活性，从而抑制RAF/MEK/ERK信号传导通路，抑制肿瘤生长；同时，又通过抑制VEGFR和PDGFR而阻断肿瘤新生血管的形成，诱导肿瘤细胞凋亡。临床试验证实索拉菲尼可延长进展期肝癌的生存时间，美国FDA2007年批准索拉菲尼用于晚期肝癌的治疗，但是，目前临床上尚未应用索拉菲尼作为肝移植术后的辅助治疗。肝移植术后索拉菲尼早期干预能否抑制肿瘤的复发与转移，从而延长患者生存时间，有待于探讨。
　　 基于肝癌诊疗中的上述问题，本课题进行了肝癌多光子光学诊断及肝移植术后索拉菲尼早期干预的实验研究。研究发现：1、肝癌的多光子光学诊断是可行的，既可诊断肝癌及肺转移灶、鉴别肝脏良恶性结节，又可区别肝癌细胞和正常细胞不同的代谢水平，并进行光学“连续切片”；2、索拉菲尼可以显著减少肝癌循环血肿瘤细胞的数量，抑制肝癌血行转移；3、肝移植术后早期应用索拉菲尼可以抑制肝癌复发与转移，从而延长生存时间。具体见以下三部分：
　　 第一部分肝癌多光子光学诊断的实验研究
　　 [目的]肝结节及可疑肺转移结节的活检存在出血、胆漏或气胸、针道转移、病理流程费时等缺点。基于非线性光学和飞秒激光镭射之上的多光子光学成像，通过利用活体组织中细胞本身产生的自体荧光及胶原组织产生的第二谐波，可以实时快速地获得组织及细胞的病理组织学特征，本节研究肝癌多光子光学诊断的可行性。
　　 [方法]首先，6只原位肝癌(Morris Hepatoma)大鼠模型的新鲜肝肺标本经多光子扫描成像，成像后标本经10％福尔马林固定、石蜡包埋、组织切片、苏木素-伊红(H-E)染色，多光子光学图片与H-E图片进行病理组织学比较：其次，60例肝切除手术新鲜标本，包括肝细胞癌、胆管细胞癌、转移癌、血管瘤、肝腺瘤、肝局灶性结节增生、肝硬化结节等，接收多光子扫描成像及常规病理取材、固定、包埋、切片、H-E染色，多光子光学图片与H-E图片进行组织形态学比较，建立多光子光学诊断标准；最后，164例组织库肝标本接受“盲法”检测，评价多光子光学诊断的敏感性、特异性、准确性。
　　 [结果]在大鼠肝癌模型中，多光子显微成像可以清晰地显示肝癌及其肺转移灶的组织结构和细胞形态，如癌细胞及其细胞核的异型性，癌细胞形态和大小不一、细胞核增大、核浆比失调等，同时，还可以进行光学“连续切片”；在60例肝切除标本中，根据肿瘤实质中的自体荧光和间质中胶原产生的第二谐波的差异，多光子显微成像不但可以鉴别各种肝良、恶性种瘤的组织学特征和细胞学形态，而且可以区别肝癌细胞和正常细胞不同的代谢水平，多光子图片与H-E图片具备可比性；在164例肝标本“盲法”检测中，多光子光学诊断的敏感性、特异性、准确性分别为96.32％，96.43％，及96.34％。
　　 [结论]多光子光学诊断对肝癌是可行的，随着微型化多光子探头、多光子内镜的出现以及光纤技术的发展，多光子光学诊断可能在肝癌实时诊断、肝良性或恶性结节鉴别、肺可疑转移灶定性、肝癌术中安全切缘确定、肝癌生物学特性判断等方面有良好的应用前景。
　　 第二部分索拉菲尼减少循环血肿瘤细胞及抑制肝癌血行转移的研究
　　 [目的]抗血管生成，作为研究肿瘤治疗的一种方法，目前有两种截然不同的观点：一种观点认为抗血管生成可以抑制肿瘤转移，另一种观点认为抗血管生成会促进肿瘤转移。索拉菲尼，作为一种血管生成抑制剂及多激酶抑制剂，其对肝癌循环血肿瘤细胞及血行转移的影响，尚不得而知。本节研究的目的是弄清楚索拉菲尼到底是抑制肿瘤转移还是促进肿瘤转移。
　　 [方法]首先，建立高转移的转染绿色荧光蛋白的肝癌原位裸鼠模型(种瘤后4周开始转移，9周死亡)，并利用活体流式细胞仪监测循环血肿瘤细胞；其次，在肝原位种瘤后4周将10只原位荷瘤裸鼠按体重随机分为两组，分别接受索拉菲尼与安慰剂治疗，对比索拉菲尼组与安慰剂组循环血肿瘤细胞的变化以及肺转移灶、原发灶的情况，检测肿瘤增殖指标Ki-67、微血管密度(CD31染血管)、凋亡及坏死，评判索拉菲尼对血行转移的影响及相应机制。
　　 [结果]活体流式细胞仪可以动态监测循环血肿瘤细胞的变化，肝原位种瘤后4周两组开始出现循环血肿瘤细胞，经索拉菲尼治疗，循环血肿瘤细胞数量明显少于安慰剂组，两组循环血肿瘤细胞的数量在肝原位种瘤后的第5周分别是1.40±0.55对比3.60±1.14(P=0.005)，第6周分别是2.00±1.00对比11.60±4.56(P=0.002)，第7周分别是2.40±1.95对比22.80±7.33(P<0.001)，第8周分别是3.80±2.77对比42.20±11.63(P=0.001)，均有显著性差异。除了循环血肿瘤细胞，8周时肺转移率索拉菲尼组也明显少于安慰剂组(20％对比100％，P=0.01)，肺转移灶大小分别是87.50±29.86μm对比404.55±155.01μm(P=0.001)，肺转移灶的荧光强度分别是169.36±90.21 photons/μm2·s对比395.51±86.50 Photons/pm2·s(P<0.001)。另外，肝原发灶体积索拉菲尼组明显小于安慰剂组(529.40±189.23 mm3对比2795.60±722.75 mm3，P=0，002)；肿瘤坏死率(74.20％±5.12％对比14.40％±7.02％，P<0.001)及凋亡率(12.37％±3.59％对比4.72％±2.54％，P=0.005)索拉菲尼组明显大于安慰剂组；肿瘤增殖(Ki-67阳性率：6.40％±2.70％对比78.80％±5.17％，P<0.001)和血管生成(微血管密度：65.60±11.26 number/m㎡对比208.00±19.24number/m㎡，P<0.001)索拉菲尼组明显小于安慰剂组。
　　 [结论]索拉菲尼可以通过抑制肿瘤增殖、阻断肿瘤血管生成、促进肿瘤凋亡及坏死来显著减少循环血肿瘤细胞的数量，抑制肝癌血行转移。该实验为索拉菲尼围手术期治疗提供动物实验依据。
　　 第三部分肝移植术后索拉菲尼早期干预抑制肝癌复发与转移的实验研究
　　 [目的]肝癌行肝移植术后易复发及转移，如何抑制复发及转移是临床急需解决的问题。索拉菲尼，2007年底经FDA批准用于进展期肝癌的治疗，其能否抑制肝移植术后复发及转移尚无定论。本节利用动物实验研究索拉菲尼对肝癌肝移植术后复发及转移的影响。
　　 [方法]首先，建立高转移的肝癌(Morris Hepatoma)原位ACI大鼠模型；其次，模拟临床同种异体肝移植术后存在排斥反应，建立Lewis大鼠为供体，ACI大鼠为受体的肝移植排斥模型；随后，12只荷瘤ACI大鼠按体重随机分为索拉菲尼组和对照安慰剂组，行肝移植并予以环孢霉素抑制排斥反应，术后1周开始分别接受索拉菲尼(30mg/kg/d，3周)和安慰剂治疗，用PET/CT检测术后复发与转移，以生存时间为首要评判指标。如生存有差异，重复实验，抽血检测血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)，比较手术前后Th1/Th2免疫平衡(γ-干扰素/白介素-4水平)的改变，并将终点事件从死亡改为术后4周肿瘤复发，比较两组肿瘤增殖、血管形成与肿瘤细胞凋亡情况。
　　 [结果]索拉菲尼辅助治疗与安慰剂相比，明显抑制肿瘤的复发及转移，延长无瘤生存时间(29.17±2.86天对比18.67±3.61天，P=0.001)及总生存时间(59.67±7.00天对比35.50±6.60天，P=0.001)。肝移植术后血清VEGF及HGF水平较术前明显升高，应用免疫抑制剂环孢霉素后Th1/Th2免疫平衡往Th2倾斜，在对照组γ-干扰素/白介素-4比率在环孢霉素应用前后分别是1.76±0.24及1.25±0.19(P=0.002)，在索拉菲尼组γ-干扰素/白介素-4比率在环孢霉素应用前后分别是1.80±0.26及1.17±0.23(P=0.001)，差别均有显著性意义。在生长因子显著升高及免疫功能显著降低的情况下，索拉菲尼显著抑制肿瘤增殖(Ki67阳性率：14.50％±3.83％对比68.67％±7.29％，P<0.001)与血管形成(微血管密度：46.67±8.16个/mm2对比189.33±19.58个/mm2，P<0.001)，促进肿瘤细胞凋亡(凋亡率：12.40％±3.65％对比4.80％±2.59％，P=0.005)。
　　 [结论]肝癌肝移植术后索拉菲尼辅助治疗可以抑制肿瘤的复发及转移，延长无瘤生存时间及总生存时间。该动物实验为临床肝癌患者肝移植术后索拉菲尼早期辅助治疗提供实验依据。