Spodoptera属Su(var)3-9的鉴定及在杆状病毒感染过程中的作用和持续增强型重组杆状病毒的构建

摘要

第一部分 Spodoptera属Su(var)3-9的鉴定及在杆状病毒感染过程中的作用
　　核小体核心组蛋白N-端的各种翻译后修饰，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及糖基化等，会影响组蛋白、DNA及多种细胞因子之间的亲和力而改变染色质的状态和基因的表达。由于这些修饰作用往往会有类似于DNA遗传密码的功效，在生物体的发育和基因的选择性表达与调控等多个方面起着至关重要的作用，故常被称为“组蛋白密码”。位点和状态专一的组蛋白赖氨酸或精氨酸甲基化修饰主要是由一类含有SET结构域的蛋白质——组蛋白甲基转移酶(HMTs)催化完成的。在众多的HMTs中，SUV39家族的Su(var)3-9特异性地负责催化组蛋白H3第九位赖氨酸(H3K9)的三甲基化，其催化反应产物H3K9mer3可以招募异染色质蛋白1(Heterochromatin protein1，HP1)，共同作用，导致异染色质化和基因沉默。同时，Su(var)3-9还能通过其N-端二聚化区与HP1的Chromo-Shadow结构域发生直接的相互作用。此外，通过HP1以及MeCP2(methyl-CpG-binding protein2)等蛋白的桥梁作用，Su(var)3-9还能间接地与其他表观遗传修饰因子如DNA甲基转移酶(DNMT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)等发生关联，进而参与到庞杂的表观遗传调控网络之中。
　　病毒侵染宿主的过程经常会对宿主细胞的正常活动产生多方面的影响，同时也会激发宿主细胞抵抗病毒侵染的自我防御。表观遗传因子时常会参与到这些过程中。目前已经知道多种DNA病毒在侵入宿主细胞核后病毒基因组会形成类似于染色质的结构，进而受多种表观遗传修饰因子的调控。另一方面，病毒也会利用宿主细胞的表观遗传机制来保证自身的正常复制。杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)在侵染草地贪夜蛾卵巢细胞系Sf9时，也会致使宿主细胞的多方面正常生物学行为发生紊乱，如造成细胞骨架的改变，细胞周期停滞于G2/M期，全局性的mRNA水平的下调和蛋白表达的关闭等等。同时也有报道证实了AcMNPV感染宿主细胞后病毒基因组中存在类似于核小体的结构，并且多种表观遗传修饰因子抑制剂都会引起病毒基因复制和转录的改变。但是在AcMNPV与宿主的相互作用过程中是否受组蛋白甲基化状态的影响，以及这种影响是通过何种方式进行的，至今尚无报道。
　　本研究在草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda），甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）及斜纹夜蛾（Spodoptera litura）三种Spodoptera属的昆虫中克隆和鉴定了组蛋白H3K9的三甲基转移酶基因Su(var)3-9及其转录剪接变体eIF2γ基因。在对Spodoptera Su(var)3-9的生物信息学分析中发现其编码的氨基酸序列在进化中高度保守，并且具有种属特异性。在体外分别表达了Su(var)3-9及eIF2γ蛋白并制备了多克隆抗血清，对其在天然情况下细胞中的表达情况进行了检测确认，应用免疫荧光实验证明Spodoptera Su(var)3-9定位于细胞核。GST pull-down实验证实了Spodoptera Su(var)3-9与底物H3的结合，同时也分别与本研究中鉴定出的两个亚型的异染色质蛋白1(HP1a、HP1b)结合。体外酶活实验表明SpodopteraSu(var)3-9具有催化H3K9三甲基化的活性并受Su(var)3-9特异性抑制剂Chaetocin的抑制，且该催化活性具有剂量依赖性，在27℃下的酶活性要明显高于37℃。体内酶活分析同样证实了Spodoptera Su(var)3-9催化组蛋白甲基化的能力以及后续产生的对细胞染色质紧实度和基因转录的影响。
　　进一步的研究发现在AcMNPV感染的Sf9细胞中，虽然绝大多数宿主细胞基因表达明显下降，Su(var)3-9转录水平却呈上升趋势，伴随宿主染色质变得更为紧实。添加抑制剂Chaetocin或过表达Su(var)3-9会分别激活或抑制AcMNPV基因组的复制和病毒极早期到极晚期的多个基因的转录。
　　综上所述，本研究首次发现组蛋白甲基转移酶Su(var)3-9在杆状病毒AcMNPV感染Sf9细胞时宿主基因表达的关闭过程中具有一定的作用，并且可能参与了细胞对入侵病毒的抵抗反应。这些结果为深入了解病毒与细胞的相互作用机制，和更好地开发利用杆状病毒-昆虫细胞系统提供了新的视野和思路。
　　第二部分牛乳头瘤病毒1型复制元件显著增强重组杆状病毒介导的外源基因在哺乳动物细胞中的表达
　　杆状病毒AcMNPV作为一种新型的哺乳动物细胞蛋白表达和基因治疗载体在近年来受到了研究者的越来越多的关注。与现有的其他病毒载体相比，它的优势主要在于:AcMNPV在哺乳动物细胞中不会复制，自身基因也不会表达，无细胞毒性;简单的操作即可获得高滴度的重组病毒;外源基因的容量大等等。然而，杆状病毒介导的外源基因在哺乳动物细胞中的表达为瞬时表达，且表达水平往往不够高，使得杆状病毒载体在哺乳动物细胞中的应用受到一定的限制。寻求增强持续表达的策略是目前亟待解决的问题。
　　牛乳头瘤病毒1型（Bovine papillomavirus type1，BPV-1）是一种小型的DNA病毒，BPV-1基因组以多拷贝游离于染色体外的方式(episome)持续存在于被感染宿主的细胞中。病毒的上游调控序列（upstream regulatory region，URR）和早期蛋白E1，E2对病毒基因组复制的发动和维持是必需的，其他复制相关因子则全部由宿主提供。此外，在有E2蛋白存在的情况下，URR还具有增强子的活性，可以对提高邻近的异源启动子的转录活性。
　　在本研究中，我们将BPV-1的这些元件引入杆状病毒基因组中，并在多个哺乳动物细胞系中比较了重组杆状病毒及对照组病毒介导报告基因的表达水平，同时还检测了重组杆状病毒的转导对哺乳动物细胞产生的细胞毒性效应。研究发现，与对照病毒相比，在HEK293、HeLa、BHK-21、CNE、CHO-K1及MDCK细胞中，携带BPV-1 URR和E1，E2元件的重组杆状病毒介导的报告基因EGFP(enhanced green fluorescence protein)的表达水平均有了非常显著的提高，表达时间也有所延长。此外，带有BPV-1复制元件的新型的重组杆状病毒载体对哺乳动物细胞没有明显的细胞毒性。
　　因此，BPV-1复制元件URR和E1，E2的存在能够明显改善杆状病毒介导的外源基因在哺乳动物细胞中的表达，并且不影响杆状病毒载体固有的生物安全性。这一结果有助于推进杆状病毒作为一种更为有效的哺乳动物细胞蛋白表达及基因治疗载体的应用。

目录

摘要

第一章 Spodoptera属Su(var)3-9的鉴定及在杆状病毒感染过程中的作用

第一节 引言

第二节 实验材料

第三节 实验步骤和方法

第四节 实验结果

第五节 讨论

参考文献

第二章 牛乳头瘤病毒1型复制元件显著增强重组杆状病毒介导的外源基因在哺乳动物细胞中的表达

第一节 引言

第二节 实验材料

第三节 实验步骤和方法

第四节 实验结果

第五节 讨论

参考文献

第三章 文献综述

第一节 表观遗传学中的组蛋白修饰

第二节 病毒感染中的组蛋白调控

第三节 杆状病毒生物学

参考文献

全文总结

论文和专利

致谢

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