抗虫转基因栽培稻和非转基因稻亲本与普通野生稻杂种F2群体的等位基因分离研究

摘要

全球转基因生物技术及转基因作物的研究处于快速发展时期，转基因作物的商品化生产和大规模种植引起了全球对转基因生物带来的潜在安全问题的广泛关注和争论。在转基因作物商品化种植面临的诸多问题中，转基因通过杂交-渐渗逃逸到栽培作物野生近缘群体导致的潜在环境和生态影响是备受关注的环境生物安全问题之一。栽培作物向野生群体的基因渐渗对于野生近缘群体动态的影响，对野生群体的进化方向具有重要意义。杂交-渐渗对于物种及其群体的进化具有重要影响，杂交-渐渗过程可以产生新的基因组合，导致遗传多样性的增加与维持;种间的杂交和基因漂移则可能导致遗传同化、湮灭和选择性剔除效应，进而对群体的进化方向产生影响。在杂交-渐渗发生以后，来源于不同亲本的基因在杂交后代群体中的存留和扩散对于杂种群体的遗传结构和进化方向均具有重要意义。在自然条件下，杂交过程受到生殖隔离的影响，生殖隔离可以分为受精前隔离和受精后隔离，生殖隔离加之自然选择的作用，导致来源于不同亲本的基因（性状）在杂交后代群体中产生非随机分离。另外，来自双亲的不同基因位点也会产生遗传作用导致的连锁。利用分子标记可以对杂种后代群体中同一位点等位基因的非随机分离和不同位点基因的连锁不平衡进行分析，了解杂交分离后代中来自双亲等位基因的分离，在栽培稻与普通野生稻杂交后代中，哪个亲本的基因具有更多的机会被保留下来，这对于杂交后代的进化方向具有重要意义。
　　本研究以栽培稻（包括抗虫转基因稻与其非转基因亲本）与普通野生稻的杂交后代为研究对象，开展了以下三个方面的研究:
　　1、构建人工杂交的栽培稻-野生稻分离群体，并选用微卫星(SSR)及插入/缺失(InDel)分子标记对F2群体中不同位点的等位基因分离比例进行研究。选取来自广东省遂溪县的野生稻群体与栽培稻品种（含转基因品种MF2及其非转基因亲本明恢86）进行人工杂交，由F1收获杂种自交得到F2分离群体，两个杂交组合的F2分离群体各自选取400个以上个体进行研究，检测F2群体中各位点等位基因的基因型频率和基因频率，并利用连续卡方的方法检验各位点中来自双亲等位基因分离的观察比值是否符合孟德尔理论比值，通过上述研究了解在遗传分离过程中来自双亲的等位基因是否受到自然选择，杂交分离后代中哪种亲本（栽培稻或野生稻）来源的基因会更多的保存下来，同时了解抗虫转基因的引入是否会对此遗传分离过程产生影响。分析结果表明:两个杂交组合中均出现了较高频率的非随机（偏态）分离（非转基因组合为25.93％，转基因组合为33.33％），发生偏态分离的位点未呈现一致的亲本偏向，只有两个位点在两个组合中均一致偏向栽培稻亲本。上述结果表明在野生稻与栽培稻杂交后代中双亲等位基因的传递具有较高频率的非随机分离，并且在某些位点上基因分离明显偏向栽培作物，这可能是受到自然选择的原因，这一现象对于探讨作物基因通过天然杂交后向野生群体发生基因渐渗，以及分析渐渗野生群体的进化方向和影响提供了遗传和分子证据。
　　2、本实验中对于转基因F2群体中抗虫转基因的遗传分离研究表明:转基因的分离符合孟德尔理论比值。转基因本身的分离对于研究转基因逃逸引起的生态风险具有重要意义，如果转基因在遗传过程中受到正选择，转基因就可能在野生群体中逐步扩散开并对野生群体产生一系列生态影响。转基因本身的分离过程可能会受到虫压及环境条件的影响，不同的环境条件可能会导致转基因产生不同的分离，因此在不同的自然环境中对于转基因的分离研究具有重要意义。
　　3、为了使等位基因分离的实验结果更接近真实水平，本研究对杂交和自交过程中产生的不同世代等位基因遗传分离的合理样本取样进行了探讨。利用模型构建的理论群体，进行F2到F5世代等位基因分离的最佳样本量，同时利用实验所获得F2群体的实际数据对理论群体的理想取样方法可靠性进行检验。结果表明:理群群体的理想抽样与实验群体的取样结果十分吻合，F2群体等位基因分离实验取样量应当达到200以上，才可能保证抽样样本所获得分离结果的可靠性。但是，随着杂交世代数的提高(F3-F5)，最适合的样本量也应该相应增加。
　　综上所述，本论文通过对含抗虫转基因和不含抗虫转基因的栽培稻与普通野生稻杂种后代中等位基因的遗传分离研究，在两个杂交组合中均发现了显著的偏态分离现象，不含转基因的组合与含有转基因的组合分别有25.93％和33.33％的位点出现了非随机分离，两个组合之间发生偏态分离的位点及偏离方向具有一定的差异，部分位点共同偏向栽培稻亲本，不同的位点之间检测到了一定的连锁不平衡，抗虫转基因的分离符合孟德尔比值，取样实验结果表明F2代的取样量应达到200以上，不同杂交世代分离实验应采取进行不同的取样量。通过上述研究本文系统阐述栽培作物与其野生近缘种群体在杂交-渐渗过程中受到的遗传影响，为理解杂交-渐渗过程中作物基因及转基因向野生群体逃逸后的进化潜力及带来的生态影响提供了科学依据。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 转基因作物的研究和发展现状

1．2 转基因逃逸带来的环境生物安全问题

1．3 作物与野生近缘种的杂交和基因渐渗

1．3．1 杂交和渐渗的概念及内涵

1．3．2 杂交-渐渗的进化意义

1．3．3 转基因逃逸及其生态影响研究案例

1．3．4 转基因渐渗及其在野生近缘种群体中的扩散

1．4 杂交-渐渗过程中的遗传分离

1．4．1 杂交-渐渗过程中双亲等位基因的遗传分离

1．4．2 杂交-渐渗过程中基因位点的连锁不平衡

1．4．3 转基因对遗传分离和连锁不平衡的潜在影响

1．5 杂交-渐渗及遗传分离和连锁不平衡的研究方法

1．5．1 传统的研究方法及其限制

1．5．2 现代分子生物学研究方法

1．5．3 等位基因分离研究的合理群体样本取样及其策略

1．6 本研究的目的、内容和意义

第二章 栽培稻-普通野生稻杂交及其F：群体的等位基因遗传分离研究

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 人工杂交构建F1群体

2．2．3 F1杂交收获材料鉴定

2．2．4 F1自交获得F2分离群体

2．2．5 SSR和InDel分子标记的筛选

2．2．6 F2分离群体PCR扩增及电泳检测

2．2．7 电泳结果数据读取和统计检验

2．3 结果

2．3．1 杂种F2群体中各位点等位基因分离

2．3．2 杂种F2群体中各位点间关联分析

2．4 讨论

第三章 栽培稻-普通野生稻F2群体中抗虫转基因的遗传分离研究

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 PCR反应及电泳检测

3．2．3 数据读取和分析

3．3 结果

3．4 讨论

第四章 栽培稻-普通野生稻杂交各世代基因分离的合理群体样本取样

4．1 引言

4．2 实验设计和方法

4．2．1 杂交各分离世代群体的理论取样

4．2．2 实际F2实验群体取样设计及检验

4．3 结果

4．3．1 杂交各分离世代的理论取样

4．3．2 利用F2实验群体的取样结果对理论取样的验证

4．4 讨论

第五章 总结与展望

参考文献

学习期间发表的论文

致谢