miR-132/212家庭在肺癌中的作用和调控Hedgehog信号通路的机制研究

摘要

肺癌是严重危害人类健康的疾病之一，其死亡率居恶性肿瘤第一位。肺癌分为小细胞肺癌(small lung cancer, SCLC)与非小细胞肺癌(Non-small cell lungcancer， NSCLC)两大类，其中非小细胞肺癌中最常见的是肺腺癌、肺鳞癌和肺大细胞癌三个亚型。microRNA是一类小的约22个核苷酸的非编码RNA，在进化上十分保守，通常作为基因表达的负调控子起作用。研究发现microRNA在人类不同类型肿瘤中表达异常或者发生突变，表明它们有可能作为一类新的原癌基因或者肿瘤抑制基因起作用。miRNA通常成簇存在于染色体上形成一个家族，迄今为止，除了少数报道，对microRNA家族在肿瘤中的作用仍然知之甚少。
　　在本研究中，我们研究了miR-132/212家族在非小细胞肺癌细胞中的作用及其调控机制。我们首先利用microRNA表达谱芯片研究了TPA刺激非小细胞肺癌细胞系A549的microRNAs表达变化，发现相比于对照细胞，许多microRNAs在受到TPA处理之后表达改变，包括miR-132/212家族的两个成员，miR-132和miR-212。为了排除芯片结果的假阳性，我们利用定量PCR检测了TPA处理的A549，H1299和BEAs-2B细胞中的miR-132和miR-212，发现TPA刺激诱导了miR-132和miR-212的高表达，这与芯片结果一致。随后我们研究了miR-132和miR-212在非小细胞肺癌细胞中的作用。在非小细胞肺癌细胞中通过瞬时转染和稳定表达miR-132和miR-212，我们发现过表达miR-132或miR-212加快了细胞增殖速度，改变了细胞周期进程，增强了细胞粘附非依赖生长的能力，促进了细胞侵袭和转移，且它们的促进效应可以被它们各自的抑制剂anti-miR-132或anti-miR-212所逆转，这些结果表明在NSCLC中，miR-132和miR-212表现出原癌基因的性质。MiR-132和miR-212属于miR-132/212家族，位于染色体17p13.3，在染色体上相距263bp。为了研究miR-132/212家族成员之间的作用关系，我们首先利用反转录PCR证明了miR-132和miR-212来源于同一个转录本。我们在H1299细胞中筛选了同时稳定表达miR-132和miR-212(miR-T)的稳定细胞株，命名为“H1299-pEGP-miR-T”，不表达任何miRNA只表达GFP的对照细胞命名为“H1299-pEGP-miR-null”，然后检测了过表达miR-T对NSCLC细胞功能的影响，发现与对照相比，同时过表达miR-132和miR-212加快了细胞增殖速度，但是抑制了细胞粘附非依赖性生长的能力，细胞侵袭和转移的能力降低;有意思的是，在H1299-pEGP-miR-T细胞中，用anti-miR-132或anti-miR-212消减掉miR-132或miR-212某一个的过表达，miR-T对细胞侵袭和转移的抑制作用被逆转，这些结果暗示了过表达miR-132和miR-212的强度有可能会对细胞侵袭和转移有不同的影响。
　　为了研究miR-132/212家族在NSCLC中的调控机制，利用生物信息学方法，我们预测了miR-132/212的靶基因，发现Hedgehog信号通路受体PTCH1是一个潜在的靶基因。Hedgehog通路是一个十分重要的细胞间信号通路，在两侧对称动物的发育过程中，控制大多数的细胞命运决定。分泌的Hh分子(Shh, Dhh，andIhh)与受体(Hip1，PTCH1，and PTCH2)结合，使另外一个跨膜蛋白Smo活化。Smo启始一系列的级联反应，导致Gli1从细胞质进入细胞核，作为转录因子起作用。利用双荧光检测、定量PCR和western blot，我们证明了PTCH1是miR-132和miR-212的一个共同的靶基因。利用RNA干扰技术，我们发现在A549、H1299和BEAs-2B细胞中用PTCH1 siRNA消减PTCH1表达加快了细胞增殖速度，这与PTCH1受到miR-132和miR-212的负调控之后的作用一致，暗示了miR-132/212家族促进细胞增殖的作用依赖于它们对PTCH1的调控。然而，在上面三种细胞中，PTCH1 siRNA减少了PTCH1表达之后抑制了细胞侵袭和转移，这与PTCH1被miR-132或miR-212所抑制的作用相反，与miR-T的作用一致，暗示了PTCH1并非是介导miR-132/212家族在肿瘤侵袭和转移方面的靶基因。我们证明了Hedgehog信号通路另外两个成员HHIP1和SUFU也可能是miR-132/212的靶基因。PTCH1、HHIP1和SUFU都是hedgehog通路的负调节因子，因此我们检测了miR-132/212家族过表达对hedgehog信号通路活性的影响，发现抑制miR-132/212家族表达能够降低hedgehog通路活性。
　　总之，我们证明了在NSCLC细胞中，miR-132和miR-212能够加快细胞增殖，增强细胞粘附非依赖生长的能力，促进细胞侵袭和转移，表现出原癌基因的作用;PTCH1是miR-132/212的一个共同靶基因，miR-132/212家族在NSCLC中的作用部分依赖于对PTCH1的调控;miR-132/212家族可能影响hedgehog信号通路活性。

目录

摘要

英文缩略词表

前言

试剂与仪器

一、试剂

二．主要仪器设备

三．生物学信息途径和计算机分析软件包

实验方法

实验结果

一、TPA诱导miR-132和miR-212在非小细胞肺癌细胞中表达上升

二、TPA在非小细胞肺癌细胞中的作用

三、稳定表达miR-132和miR-212细胞群的建立及鉴定

四、在非小细胞肺癌中，miR-132和miR-212表现出原癌基因的性质

五、miR-132／212是一个双顺反子microRNA家族

六、miR-132／212家族(miR-T)在非小细胞肺癌中的作用

七．MiR-132／212家族调控hedgehog信号通路成员PTCH1，HHIP1和SUFU

八、miR-1321212家族的部分细胞功能依赖于它们对PTCH1的调控

九、miR-132／212家族有可能影响hedgehog信号通路活性

讨论

参考文献

小结

总结与展望

攻读博士期间发表的论文

致谢

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