乙酰胆碱酯酶抑制剂对对乙酰氨基酚所致肝损伤的影响及其机制

摘要

本课题通过研究乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEI）对对乙酰氨基酚（APAP）所致肝损伤的影响及其机制，以指导老年痴呆病人合理安全用药。
　　首先，第一部分研究了AChEI对APAP所致肝损伤的保护作用的研究：C57BL/6J小鼠按体重随机分为对照（CON）组、APAP组、石杉碱甲（Hup A）组、多奈哌齐（Don）组、利凡斯的明（Riv）组、APAP+Hup A组、APAP+Don组、APAP+Riv组，每组10只。CON组和APAP组给予0.5％羧甲基纤维素钠；其他各组分别给予Hup A（0.2 mg/kg）、Don（4 mg/kg）、Riv（2 mg/kg）；连续给药4天，末次给药前12 h禁食，末次给药后2 h，CON组、Hup A组、Don组及Riv组动物腹腔注射生理盐水，其他各组动物腹腔注射APAP（300 mg/kg），8 h后取血，测定全血乙酰胆碱酯酶（AChE）活力及血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活力；取脑，制备匀浆，测定脑组织中AChE活力；肝脏常规石蜡包埋、切片，HE染色观察肝组织病理学变化。第二部分研究了AChEI对 APAP所致肝损伤保护作用机制的研究：①小鼠按体重随机分为CON组、Hup A组、Don组、Riv组、新斯的明（Neo）组、APAP组、APAP+Hup A组、APAP+Don组、APAP+Riv组、APAP+Neo组，每组10只。CON组和APAP组给予0.5%羧甲基纤维素钠；其他各组分别给予Hup A（0.2 mg/kg）、Don（4 mg/kg）、Riv（2 mg/kg）、Neo（0.15 mg/kg）；连续给药4天，末次给药前12 h禁食，末次给药后2 h，CON组、Hup A组、Don组、Riv组、Neo组动物腹腔注射生理盐水，其他各组动物腹腔注射APAP（300 mg/kg），8 h后取血，测定全血 AChE活力及血清中ALT、AST活力；取脑，制备匀浆，测定脑组织中AChE活力；肝脏常规石蜡包埋、切片，HE染色观察肝组织病理学变化。②方法1中，取各组小鼠肝脏制备匀浆，检测肝脏内GSH的含量；提取肝微粒体，检测CYP2E1酶的活力。③小鼠按体重随机分为CON组、APAP组、Hup A组、Riv组、阿托品（Atr）组、美加明（Mec）组、甲基牛扁亭（MLA）组、Atr+Hup A组、Atr+Riv组、Mec+Hup A组、Mec+Riv组、MLA+Hup A组、MLA+Riv组，每组10只，连续给药4天，末次给药前12 h禁食，末次给药后2 h，CON组动物腹腔注射生理盐水，其他各组腹腔注射APAP300 mg/kg，8 h后处理各组动物。测定小鼠血清ALT和AST活力；肝脏常规石蜡包埋、切片，HE染色观察肝组织病理学变化。检测肝组织线粒体中ATP含量、ROS含量、细胞色素C的浓度；测定肝脏内TNF-α及IL-6的mRNA表达水平及蛋白含量，检测线粒体中HMGB1的浓度和JNK2的磷酸化。
　　第一部分实验结果显示，与CON组相比，APAP组血清ALT（p<0.01）、AST（p<0.05）活力显著升高，围绕中央静脉可见大片肝细胞坏死；与APAP组相比，APAP+Hup A组、APAP+Don组、APAP+Riv组小鼠脑组织内AChE活力及血清ALT、AST活力显著降低（p<0.05），肝细胞坏死明显减少。第二部分结果显示，①与CON组相比，APAP组小鼠血清ALT、AST活力显著升高（p<0.01），围绕肝脏中央静脉可见大片细胞坏死；与APAP组相比，APAP+Neo组小鼠全血AChE活力显著降低（p<0.01），脑内AChE活力无显著变化，血清ALT、AST活力未见显著变化，组织病理学结果仍可见大片坏死肝细胞。②与 CON组相比，APAP组小鼠肝脏GSH的含量显著减少（p<0.01）；与APAP组相比，APAP+Hup A组、APAP+Don组、APAP+Riv组小鼠肝脏内GSH的含量均未见显著性差异。各组间肝脏CYP2E1的酶活性也无显著变化。③与CON组相比，APAP组小鼠血清ALT、AST活力显著升高（p<0.01）；围绕中央静脉以及中央静脉连接间肝细胞成片坏死；肝脏线粒体内ATP含量和细胞色素C含量显著减少，ROS的浓度显著升高（p<0.05）；肝脏TNF-α、IL-6的mRNA表达水平及蛋白含量及线粒体中HMGB1的浓度显著升高（p<0.05），磷酸化JNK2显著增加（p<0.05）。与APAP组相比，Hup A组、Riv组小鼠血清ALT、AST活力显著降低（p<0.05），肝细胞坏死减轻；肝脏线粒体内ATP含量和细胞色素C含量显著增加，ROS的浓度显著降低（p<0.05）；肝脏TNF-α、IL-6的mRNA表达水平及蛋白含量及线粒体中HMGB1的浓度显著降低（p<0.05），磷酸化JNK2显著减少（p<0.05）。与Hup A组或Riv组相比，Atr+Hup A组或Atr+Riv组小鼠肝脏线粒体内ATP含量和细胞色素C含量显著减少，ROS的浓度显著升高（p<0.05）；MLA+Hup A组或MLA+Riv组小鼠肝脏TNF-α、IL-6的mRNA表达水平及蛋白含量及线粒体中HMGB1的浓度显著升高（p<0.05），磷酸化JNK2显著增加（p<0.05）。
　　根据上述实验结果，我们认为用于治疗老年痴呆的乙酰胆碱酯酶抑制剂不加重对乙酰氨基酚所致肝损伤，而对其具有保护作用；乙酰胆碱酯酶抑制剂对对乙酰氨基酚所致肝损伤的保护作用与其抑制中枢乙酰胆碱酯酶活性有关；乙酰胆碱酯酶抑制剂通过 M乙酰胆碱受体的激动保护肝脏线粒体功能；并通过间接刺激N乙酰胆碱受体α7亚型，减少促炎细胞因子释放和JNK2磷酸化，从而减轻对乙酰氨基酚所致肝损伤。

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前言

1 阿尔茨海默病

1.1 阿尔茨海默病概述

1.2 AD的药物治疗

2 药物的肝毒性

2.1 对乙酰氨基酚诱导肝损伤

2.2 乙酰胆碱酯酶抑制剂的肝毒性风险

3 安全合理用药

实验研究

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 实验药品

1.3 实验试剂

1.4 实验仪器

1.5 药品与试剂配制

2 实验方法

2.1 实验分组及给药

2.2 指标测定

2.3 统计学处理方法

3 实验结果

3.1 AChEI对APAP所致肝损伤的影响

3.2 AChEI减轻APAP所致小鼠肝损伤的机制研究

讨论

结论

参考文献

致谢

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