基于材料表面图案化技术研究细胞形状和表面手性特征对干细胞黏附与分化的影响

摘要

新一代生物材料的设计在很大程度上依赖人类对细胞-材料相互作用规律的认识。如果将细胞外基质(ECM)和邻近的其它细胞都看作是广义“材料”的话，我们可以认为细胞本身就生存于“材料”世界里。生物体内的细胞无时无刻不与“材料”发生接触和相互作用，且细胞特定功能的实现在很大程度上也依赖于其所处的细胞微环境。生物材料学中的一个核心任务便是对细胞微环境进行仿生，即通过外界材料的设计与加工来模拟体内ECM的结构与功能，从而帮助组织或器官获得快速而有效的修复。因而，研究并揭示细胞-材料相互作用中各种因素的作用效应和机理在生物材料学、细胞生物学、组织工程和再生医学中都极为重要，也是生物医用材料中共性的重大科学问题。
　　在传统的细胞培养体系中，影响细胞-材料相互作用的多种因素（细胞因素、细胞外基质因素和可溶性因子）往往混杂在一起而难以分开。得益于先进材料的发展，材料表面图案化技术可用于构建具有细胞黏附反差特性的图案，进而达到对细胞黏附的精确控制。该技术有望用于单独研究各种因素对细胞黏附、迁移、增殖和分化等行为的影响，从而为深入准确地理解细胞-材料相互作用提供独到的手段。
　　骨髓基质干细胞具有自我复制更新的能力和多向诱导分化潜能，且可以取自于成体而不涉及伦理问题，因而成为再生医学和组织工程中理想的种子细胞类型。在干细胞相关的研究领域，考察并了解调节干细胞分化的各种因素一直是科学家关注的焦点，这些因素的组合应用能够最大程度地保障干细胞朝着需要的方向进行定向分化。
　　本博士论文以骨髓基质干细胞为模型细胞，借助于独到的聚乙二醇(PEG)高分子水凝胶图案化技术和分子自组装技术研究了细胞形状、基底表面的分子手性特征（分子旋光性）和几何手性特征对干细胞黏附与分化行为的影响。
　　本文的主要创新性工作和科学发现包含以下几个方面:
　　(1)发展了聚乙二醇水凝胶表面制各细胞黏附微阵列的技术，获得了具有强烈细胞黏附反差的图案化表面，实现了对细胞形状的持久控制，并首次揭示细胞形状是调控干细胞分化的一种内在因素。发展了图案转移技术，设计并制备了具有持久抗细胞黏附反差的PEG水凝胶微米图案，为单细胞形状的持久控制提供了强有力的材料手段。利用该图案化技术，本研究在国际上首次实现了对细胞形状长达19天的控制。发现干细胞形状在诱导液和基础培养液环境下均能显著影响其分化行为:成骨分化在长径比为2左右达到峰值，而成脂分化随着长径比的增加单调下降。此外，本文还对这一形状效应发挥作用的调控机理作了探讨，首次揭示并确证了形状效应是一种内在的、独立于可溶性诱导因子的影响细胞分化行为的因素。这也表明在不借助于外界任何可溶诱导因子的条件下，可以通过单独的材料手段实现对干细胞形状的控制进而调控其分化行为。
　　(2)综合有无图案化分子手性表面的制备，首次考察了材料表面分子的旋光性对干细胞行为的影响，发现分子手性特征可以显著影响干细胞的黏附和分化。利用L型半胱氨酸和D型半胱氨酸在金表面的接枝修饰和独特抗细胞黏附反差水凝胶微米图案的制备，本研究同时设计并制备了分子手性（L型和D型）表面与分子手性物质的微图案，并在这些表面对骨髓基质干细胞进行了培养与诱导分化。研究结果首次揭示了材料的分子手性特征能显著影响干细胞的黏附与分化行为。更深入的研究表明，材料表面的分子手性特征很可能是由于首先导致了蛋白吸附及细胞黏附面积的差异（对应于不同的细胞应力），进而影响了干细胞的分化行为。
　　(3)设计并制备了具有几何手性微米岛的PEG水凝胶表面，首次探讨了细胞黏附微环境的几何手性特征对干细胞行为的影响，并发现该几何手性特征是细胞极性和分化的调控因素。在持久抗细胞黏附的PEG水凝胶表面成功设计、并制备了具有几何手性特征的螺线图案（顺、逆时针旋转）。根据对几何手性图案表面单细胞黏附和分化状况的统计，本研究首次发现，基底螺线图案的手性特征（顺、逆时针旋转）能够显著影响干细胞的极性取向和分化行为。进一步分析表明，细胞在几何手性微米图案上经“诱导”产生的细胞极性和细胞骨架可能存在的“固有手性特征”共同作用导致了顺时针和逆时针图案上细胞应力的差异，进而最终影响了干细胞的分化行为。顺时针图案上干细胞应力相对较大而利于成骨分化，而逆时针图案上干细胞应力相对较小而利于成脂分化。
　　本文借助独到的高分子材料技术探讨了原本相互交织、难以阐明的细胞-材料相互作用中的若干基本科学问题。相关研究尤其拓展了对于干细胞行为调控因素的认识，这为深入理解细胞-材料相互作用这个经典难题提供了新的思路与方法，也为新型生物医用材料的设计和研发奠定了部分理论基础。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 前言

1．2 细胞-材料相互作用

1．3 适用于细胞研究的材料表面图案化技术

1．3．1 典型的微米图案制备技术

1．3．2 典型的纳米图案制备技术

1．4 细胞图案化的研究进展

1．4．1 细胞黏附

1．4．2 干细胞分化

1．4．3 细胞迁移

1．4．4 细胞增殖

1．5 本课题的提出

参考文献

第二章 高分子水凝胶微米图案的制备及其持久抗细胞黏附反差的特性

摘要

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 仪器与试剂

2．2．2 硬质基底表面金微米图案的制备

2．2．3 持久抗细胞黏附PEG水凝胶表面微米图案的制备

2．2．4 水凝胶表面金微米图案的RGD接枝修饰

2．2．5 骨髓基质干细胞的分离与扩增培养

2．2．6 干细胞在图案表面的接种与培养

2．2．7 图案表面干细胞的荧光染色

2．3 结果与讨论

2．3．1 高分子PEG水凝胶表面图案的制备

2．3．2 干细胞的分离与扩增

2．3．3 高分子水凝胶图案对细胞黏附的控制及其持久性的维持

本章小结

参考文献

第三章 细胞形状对干细胞分化行为的影响及固有形状效应的揭示

摘要

3．1 前言

3．2 干细胞诱导分化的形状效应

3．2．1 实验部分

3．2．2 结果与讨论

3．3 不同形状干细胞在无诱导因子条件下的分化行为与最佳长径比

3．3．1 前言

3．3．2 实验部分

3．3．3 结果与讨论

3．4 形状效应影响干细胞分化的机理探讨

3．4．1 实验部分

3．4．2 结果与讨论

本章小结

参考文献

第四章 材料表面分子的旋光性对干细胞黏附和分化行为的影响

摘要

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 仪器与试剂

4．2．2 旋光性物质自组装单分子层表面的构建与表征

4．2．3 PEG水凝胶表面半胱氨酸微阵列的构建

4．2．4 骨髓基质干细胞的分离与扩增培养

4．2．5 干细胞在半胱氨酸表面和微阵列上的接种

4．2．6 干细胞在半胱氨酸表面黏附状况的评估

4．2．7 干细胞的免疫荧光染色

4．2．8 干细胞在半胱氨酸表面的诱导分化

4．2．9 分子手性表面MSC诱导分化后的表征

4．3 结果与讨论

4．3．1 分子手性表面的制备与表征

4．3．2 分子手性表面的蛋白吸附

4．3．3 干细胞在分子手性表面的黏附

4．3．4 干细胞在分子手性表面的分化

4．3．5 分子手性图案表面的构建及微米岛上单细胞的分化

本章小结

参考文献

第五章 细胞黏附微环境的几何手性特征对干细胞极性和分化行为的调控

摘要

5．1 前言

5．2 实验部分

5．2．1 仪器与试剂

5．2．2 PEG水凝胶表面具有几何手性特征微米图案的设计与制备

5．2．3 骨髓基质干细胞的分离与扩增培养

5．2．4 细胞在几何手性微米图案上的接种

5．2．5 几何手性微米图案上MSC的免疫荧光染色

5．2．6 几何手性微米图案上MSC的诱导分化

5．2．7 几何手性微米图案上MSC成骨和成脂分化的表征

5．3 结果与讨论

5．3．1 几何手性微米图案的构建

5．3．2 细胞在几何手性微米图案表面的黏附

5．3．3 细胞在几何手性微米图案表面的诱导分化

本章小结

参考文献

第六章 全文总结

6．1 创新性总结

6．2 理论与实际意义

6．3 不足与展望

作者简历

致谢

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