拟南芥中酰基转移酶DRL1调控体内油菜素甾醇的动态平衡

摘要

植物甾醇类激素油菜素甾醇（英文为brassinosteroids，简称BRs）在调节植物的生长发育过程和响应多种环境因素中发挥了很重要的作用，这些进程包括细胞伸长、细胞分裂及分化、叶脉形成、茎干延长、光形态建成和繁殖发育、衰老和逆境胁迫响应等。油菜素甾醇在植物的花粉，种子和年轻的营养器官中低水平表达，因此由合成和代谢途径共同调控的油菜素甾醇动态平衡是调控植物体内油菜素甾醇含量的一种重要形式。到目前为止，BRs的合成途径已经了解得比较透彻，但对于代谢途径却有待更深一步地挖掘。
　　本研究以Col-0为材料，构建了激活标签的群体，在筛选中发现了一个比较有趣的突变体，经鉴定是一个显性突变体，命名为drl1-D(dwarf and roundleaf-1)，它显示了一种类似BR缺失或不敏感突变体的表型，包括叶片短圆、衰老延迟和植株矮化等特征。进一步通过TAIL-PCR，实时定量PCR以及回交和过表达植株的表型观察等实验确认，基因DRL1(At4g31910)单一性地决定了突变体的表型。接下来，我们通过多方面的研究来探索造成这个突变体表型的基因DRL1的功能。首先，通过生理实验（对含有不同浓度BRs的培养皿上生长的下胚轴长度的变化和BRs对根的抑制实验），分子（BR信号的标记基因的转录表达水平的变化）和生化（BR信号的蛋白标记BES1磷酸化状态）实验，发现突变体drl1-D能对BRs进行响应，但是信号输出能力下降。这些结果明基因DRL1不是参与BR的信号途径，可能是参与了BR合成或代谢途径。其次，测定了突变体drl1-D和野生型Col-0内源BRs的水平，发现typhasterol(TY)、6-deoxotyphasterol(6-deoxoTY)和6-deoxocastasterone(6-deoxoCS)这三种中间形式的BR含量相对于野生型Col-0来说显著降低，而上游的BR中间形式6-deoxoTE和6-deoxo3DT却没有发生累积，表明基因DRL1可能参与了BR的代谢途径。接着，用基因DRL1的启动子驱动的GUS转基因材料染色表明基因DRL1广泛存在于植物的叶片、根、花和荚果中。已有研究表明DRL1基因编码了一种酰基转移酶，我们通过体外酶活实验也辅佐证实了DRL可能参与了BR中间产物的酯化反应。探究发现，T-DNA插入缺失突变体DRL1-KO相对于Col-0无明显表型，因此我们认为存在同源基因起共同调控作用。现有的文献表明在进化上与DRL1同源，并处于同一分支的基因共有15个，其中只有两个基因At5g17540和At2g40230的过表达植株出现了植株矮小、叶柄变短、叶片短圆的表型，表明这两个基因有可能是与DRL1最同源的基因。双缺突变体At5g17540KD/At2g40230KO也表现出比野生型更大，BR信号输出增强的表型。除此之外，DRL1，At5g17540和At2g40230这三个基因都受到eBL的诱导以及ABA的抑制。最后，将这个拟南芥的基因DRL1在水稻中过表达，转基因水稻有矮化直立的表型，并且植株体内BR信号确实下调了，但是育性没有受到影响，表明该转基因水稻有可能成为合理密植，增加水稻产量的新品种。

目录

声明

摘要

第一章 综述

1．1 油菜素甾醇的合成途径

1．2 油菜素甾醇合成基因的组织特异性表达以及内源BRs的分布

1．3 油菜素甾醇的代谢途径

1．3．1 BR代谢过程中的修饰方法

1．3．2 BR修饰相关的基因

1．3．3 外界刺激因素对于BR修饰基因的调节

1．3．4 现有发现的BRs酯化反应

1．4 油菜素甾醇的信号途径

1．4．1 BRs的受体BRI1

1．4．2 转录因子BES1和BZR1

1．5 现有酰基转移酶的功能

1．6 本论文研究的生物学问题

第二章 实验材料和实验方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料和培养条件

2．1．2 菌株

2．1．3 酶

2．1．4 抗体

2．1．5 载体

2．1．6 抗生素

2．1．7 蛋白纯化介质

2．1．8 试剂盒

2．1．9 主要的化学试剂

2．1．10 主要的实验仪器

2．1．11 图像及数据分析软件

2．2 实验方法

2．2．1 载体的构建

2．2．2 融合蛋白体外表达及纯化

2．2．3 拟南芥基因组DNA的提取

2．2．4 反转录PCR

2．2．5 基因表达谱分析

2．2．6 实时定量PCR检测基因表达

2．2．7 拟南芥的杂交

2．2．8 T-DNA插入突变体的鉴定

2．2．9 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2．2．10 质粒的提取

2．2．11 农杆菌感受态细胞的制备和转化

2．2．12 农杆菌介导的拟南芥转化

2．2．13 植物材料的种植

2．2．14 激活标签群体的构建及鉴定

2．2．15 激素处理实验

2．2．16 BR含量的测定

2．2．17 蛋白样品的提取及免疫分析

2．2．18 油菜素甾醇相关化合物的合成

2．2．19 酰基转移酶催化活性的实验

第三章 酰基转移酶DRL1在BR代谢中的功能研究

3．1 激活标签群体的构建以及突变体drl1-D的表型分析

3．2 突变体drl1-D与BRs的关系

3．3 突变体drl1-D的鉴定

3．4 基因DRL1功能的探索

3．5 基因DRL1受植物激素的调节

3．6 同源基因的相关特性

3．7 基因DRL1在水稻中的应用

第四章 讨论与展望

4．1 结论

4．2 讨论

4．3 展望

参考文献

附录

在读期间发表论文及申请专利

致谢