LC-MS/MS测定单抗迪诺塞麦方法建立及其在猴体内药代动力学研究中的应用

摘要

传统的单抗药代动力学测定方法为ELISA法，该方法直接、快速、灵敏度高且可用于高通量测定。但其具有测定范围较窄、精密度差、获得特异的抗原或抗体周期长以及易受内源性物质干扰等局限性。因此人们一直在探讨新的分析方法，其中将待测蛋白酶解后获取目标肽段，然后采用LC-MS/MS进行蛋白定量的方法可弥补ELISA方法的缺点，其有较宽的分析范围、较好的精密度、分析灵敏度高（定量下限可达1 ng/mL）、可进行多组分同时测定，与稳定同位素标记的内标和适当的抗体富集处理过程相结合使结果更加准确。本文采用抗人IgG抗体富集法和免疫富集法以LC-MS/MS定量血清中的迪诺塞麦并应用于猴体内药代动力学研究。
　　方法的建立：比较研究了抗人IgG抗体富集法和免疫富集法两种样品前处理方法捕获血清中的迪诺塞麦，同时采用100 mM醋酸/水溶液作为蛋白解偶联溶液，所得两种方法的平均绝对提取回收率分别为81.7％和86.9%；解偶联后的样品选用25 mM DTT与50 mMIAA变性，37.5℃过夜酶解，酶解液经HLB小柱除盐，洗脱液经浓缩进样，LC-MS/MS测定。测定选用来自Fc段的16肽VVSVLTVVHQDWLNGK作为检测肽段；同位素标记的VVSV[L(13C6；15N)]TVVHQDW[L(13C6；15N)]NGK肽段作为内标；色谱柱：Poroshell120 EC-C18（2.1×100 mm I.D.，2.7μm粒径）；梯度洗脱，流动相A为0.1%甲酸/水，B为甲醇；流速：0.45 mL/min；柱温：50℃；进样量：5μL。采用电喷雾离子化源（ESI），正离子方式检测，扫描方式为多反应监测（ MRM），目标多肽和同位素内标分析离子对分别为 m/z599.0[M+3H]3+/798.4[M+1H]1+，m/z603.3[M+3H]3+/805.3[M+2H]2+。
　　方法学验证：LC-MS/MS结合抗人IgG抗体富集法和免疫富集法的线性范围分别为0.05～20.0μg/mL和0.1~30.0μg/mL；最低定量下限分别为0.05μg/mL和0.1μg/mL；日间、日内精密度分别为3.5%～9.8%和1.9%～14%，日间、日内准确度（RE%）分别为-3.3%~-1.2%和-4.7%～-1.6%；提取回收率分别为66.9%～77.8%和65.2%～90.4%；血清样品室温放置4 h、反复冻融3次及样品处理后放置24 h后均稳定，由以上结果可知两种方法均满足猴血清中迪诺塞麦的定量分析。
　　猴体内药代动力学研究：应用LC-MS/MS对迪诺塞麦在猴体内药代动力学进行评价，根据所测得的血药浓度计算得到药代参数如下：采用抗人 IgG抗体富集法和免疫富集法测得迪诺塞麦在猴体消除半衰期t1/2（均值±标准差）分别为223.6±53.2 h和196.2±109 h，药时曲线下面积 AUClast分别为13613.6±2832.8μg·h/mL和11366.9±1022.8μg·h/mL；AUCall分别为16100.7±3189.4μg·h/mL和12348.1±1809.3μg·h/mL；Tmax分别为88.0±14 h和88.0±14 h；Cmax分别为42.7±5.5 ug/mL和30.7±4.9 ug/mL。采用ELISA方法检测迪诺塞麦在猴体内消除半衰期t1/2为185.1±109 h，药时曲线下面积AUClast为12361.0±1240.1μg·h/mL；AUCall为13378.2±2077.6μg·h/mL；Tmax为88.0±14 h；Cmax为33.4±2.1 ug/mL。以上三种方法所得药时曲线趋势相似且抗人IgG抗体富集法所测得AUC略高与另外两种方法。
　　创新点：为了获取较高的灵敏度以便更为准确的揭示药物的药代动力学特征，本文利用市售RANKL蛋白均标记了Fc标签这一特性，创新性的设计了应用蛋白A磁珠结合RANKL分子，设计了免疫富集方法来捕获猴血清中的迪诺塞麦；同时建立了测定IgG2类单抗临床前PK特征的通用性方法：抗人IgG抗体富集法，来评价迪诺塞麦在猴体内药代动力学特征。所得结果与ELISA方法结果一致。

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符号说明

1前言

1.1 单克隆抗体

1.2 迪诺塞麦

1.3 目前单抗药代动力学研究方法概况

1.4 LC-MS/MS测定单抗临床前药代动力学概况

1.5 研究意义及目的

2 建立并优化LC-MS/MS测定迪诺塞麦在猴体内药代动力学方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.5 实验结果

3 LC-MS/MS测定迪诺塞麦方法学验证

3.1 实验材料

3.2 抗人IgG抗体富集法

3.3 免疫富集法

3.4 实验结果与讨论

4 迪诺塞麦在猴体内药代动力学评价

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果及讨论

5 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

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